郑州大学睢晓洁 AHM：可便捷用于伤口修复的干细胞低温保存平台

2025-01-12 来源：高分子科技

近年来，负载干细胞的3D支架作为组织工程构建物为代替和修复受损组织（如皮肤、骨/软骨、脊髓等）提供了一种极具前景的解决方案。该组织工程构建物的广泛应用依赖于干细胞的高效低温保存，但其仍面临以下挑战：1）干细胞在低温保存时，需使用有毒冷冻保护剂（如DMSO）以抑制冰晶损伤；2）解冻复苏后，需要进行复杂的洗脱步骤以去除这些有毒保护剂；3）解冻后的干细胞通常需要整合至3D支架中以便后续的组织工程应用。因此，开发一种基于3D支架的干细胞低温保存平台，并消除有毒冷冻保护剂的使用，提供“现货型”组织工程构建物变得越来越重要。

近日，郑州大学生命科学学院睢晓洁副教授提出了一种新型的干细胞低温保存平台。该平台通过联合聚乙烯吡咯烷酮/结冷胶/明胶（PGG）抗冻支架包封策略和L-脯氨酸诱导的细胞预脱水策略，实现了干细胞的高效低温保存（复苏存活率达95%），且避免了传统有毒冷冻保护剂（如DMSO）的使用。在解冻复苏后，包封小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的PGG抗冻支架可作为组织工程构建物（BMSCs@PGG）直接应用于小鼠皮肤急性损伤修复，促进伤口愈合，为实现干细胞的高效保存和便捷应用提供了新思路。

相关研究成果以“An Antifreezing Scaffold-based Cryopreservation Platform of Stem Cells for Convenient Application in Wound Repair”为题发表在《Advanced Healthcare Materials》杂志上。

图1. 便捷用于伤口修复的干细胞低温保存平台示意图

1. PGG抗冻支架的制备与表征

为了避免低温保存过程中与冰相关的损伤，作者使用聚乙烯吡咯烷酮、结冷胶/钙离子和明胶设计制备了具有半互穿网络结构的抗冻支架，命名为PGG支架（图2A）。傅里叶红外光谱证明了PGG支架的成功制备（图2B）。同时，PGG支架具有优异的溶胀性能和生物降解性能，有助于其包封细胞以及后续的组织工程应用（图2C,D）。

图2. PGG抗冻支架的制备与表征

随后作者分别从热力学、动力学和原子尺度表征了PGG支架的抗冻性能。差示扫描量热法（DSC）结果表明PGG支架具有降低冰点和可冻结水含量的能力，并且这种能力随着结冷胶占比的增加而变强。以PGG_4:1支架为例，低场核磁（LF-NMR）结果表明PGG_4:1支架可以将水分子限制在支架内部，削弱水分子的流动性（图3D,E）。拉曼光谱（Raman）结果显示，PGG_4:1支架能够破坏水分子间氢键的有序排列（图3F,G）。作者通过密度泛函理论计算证明了PGG_4:1支架中的各个组分都与水分子有着更强的相互作用，使其能够破坏水分子间的氢键网络。这些结果显示PGG_4:1支架具有良好的抗冻能力，有利于抑制细胞在低温保存过程中的冰相关损伤。

图3. PGG支架抗冻性能的表征

2. L-脯氨酸诱导细胞预脱水

PGG支架作为一种大分子材料，无法穿透细胞膜提供细胞内保护作用。因此，作者采用L-脯氨酸诱导的细胞预脱水策略，以降低细胞内的水分含量，进而抑制细胞内冰晶的形成，减少其对细胞的损伤。（图4A）。实验结果证实，通过调整L-脯氨酸的诱导时间，能够有效控制细胞的脱水程度（图4B,C）。并且，L-脯氨酸可以作为一种渗透调节剂，缓解细胞在低温保存时所遭受的渗透胁迫（图4D-G）。

图4. L-脯氨酸诱导的细胞预脱水

3. 低温保存平台的构建

基于此，作者提出了一种联合PGG抗冻支架包封策略与L-Pro诱导细胞预脱水策略的低温保存平台，旨在保护BMSCs免受低温损伤（图5A）。作者首先证明了BMSCs可以很轻松地负载在PGG支架中，且这一过程并不会影响细胞存活率（图5B-D）。通过对L-Pro使用浓度（图5F）与孵育时间（图5G）的筛选，最终选择使用4% L-Pro孵育1 h后包封在PGG支架中进行低温保存的策略，解冻后干细胞的即时存活率可达95%（图5H），48 h存活率可达86%（图5I）。同时，该低温保存平台具备长期保存BMSCs的能力（>大于4个月），且对其他来源（如大鼠骨髓来源）的间充质干细胞也具有高效的低温保护作用（图5J,K）。

图5. 低温保存平台的构建

4. 生物相容性测试

良好的生物相容性可以减少细胞与材料之间的不良反应，保障移植后细胞的存活和功能，推动临床应用。作者通过细胞活/死荧光染色实验、溶血实验以及小鼠皮下包埋PGG_4:1支架实验，证明了平台所用材料具有良好的细胞相容性（细胞存活率均高于95%）、血液相容性（溶血率均低于5%）和组织相容性（不引起急性和慢性炎症）。与传统的基于DMSO的低温保存方法相比，该低温保存平台避免了在解冻后需要进行繁琐的保护剂脱除步骤。

图6. 生物相容性测试

5. 解冻后干细胞的体外功能评估

鉴于低温保存平台的优异生物相容性，作者将解冻后的BMSCs@PGG_4:1作为组织工程构建物进行培养，以评估其解冻后干细胞的体外功能。细胞增殖和分化结果显示，解冻后的BMSCs@PGG_4:1不仅保持了增殖能力（图7A），还展现出分化为脂肪细胞和软骨细胞的潜力（图7B）。旁分泌实验结果如图7C-F所示，经新鲜BMSCs@PGG_4:1或冻存BMSCs@PGG_4:1条件培养基（CMs）处理的L929细胞和HaCaT细胞，其增殖率和迁移率相较于空白对照组均显著提升。综上所述，低温保存后的干细胞保持了增殖、分化和旁分泌能力。

图7. 解冻后干细胞体外功能的评估

6. 解冻后的BMSCs@PGG作为组织工程构建物用于伤口修复

进一步地，作者构建了小鼠皮肤急性损伤模型，以评估解冻后BMSCs@PGG_4:1作为组织工程构建物在皮肤再生中的应用效果（图8A）。如图8B,C所示，新鲜BMSCs@PGG_4:1组和冻存BMSCs@PGG_4:1组伤口愈合速度与空白对照组相比明显加快。治疗后第14天，皮肤H&E染色图像显示，新鲜BMSCs@PGG_4:1组和冻存BMSCs@PGG_4:1组炎症细胞浸润减少，成纤维细胞增加，并伴有伤口区域新血管结构的形成（图8D）。此外，相比于空白对照组和新鲜BMSCs组，新鲜BMSCs@PGG_4:1组和冻存BMSCs@PGG_4:1组第14天的新生皮肤具有较薄的表皮（图8F）、较少肉芽组织（图8G）、更完整的真皮（图8H）以及更多的胶原沉积（图8E,I）。

免疫荧光结果显示，新鲜BMSCs@PGG_4:1组或冻存BMSCs@PGG_4:1组均可以降低促炎因子IL-6、TNF-α的表达，提高IL-10、CD206抗炎因子及α-SMA、CD31促血管生成因子的表达（图9）。综上所述，低温保存后的BMSCs@PGG_4:1能够有效调控伤口部位的炎症反应、促进血管生成以及促进胶原蛋白的有序沉积，从而加速伤口愈合的过程。

图8. 解冻后干细胞体内功能的评估

图9. 第14天创面皮肤组织的免疫荧光染色。

综上，作者构建了一种新的BMSCs低温保存平台，该平台通过使用PGG抗冻支架以抑制细胞外冰晶的形成，并联合L-Pro诱导的细胞脱水策略以最大程度的减少细胞内冰晶的形成，最终实现了干细胞的高效低温保存，且摒弃了传统有毒保护剂的使用。由于PGG支架的优异生物相容性和独特的3D结构，解冻后的BMSCs@PGG不用进行任何洗涤过程，可以直接作为组织工程构建物用于治疗小鼠皮肤急性损伤。

郑州大学硕士研究生周生熙、张琨副教授为该论文的共同第一作者，郑州大学睢晓洁副教授为通讯作者。该研究获得了国家自然科学基金、中国博士后科学基金、河南省重点研发与推广专项和河南省海外创新人才引进等项目的资助。

原文链接：https://doi.org/10.1002/adhm.202404228

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（责任编辑：xu）

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