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任杰，任天斌（同济大学材料科学与工程学院纳米与生物高分子材料研究所，上海200092）
摘要: 总结了应用于组织工程的几种聚乳酸及其共聚物和复合材料，以及组织工程支架材料的各种制备方法，简述了聚乳酸类可降解材料在骨组织工程、皮肤组织工程、血管组织工程等方面的应用研究进展。关键词：聚乳酸，组织工程，聚合物支架
1. 组织工程和组织工程支架 组织工程是应用工程科学和生命科学的原理，开发用于恢复、维持及提高受损伤组织和器官功能的生物学替代物的科学[1]。这是一种通过细胞培养而直接获得新组织和器官的新技术, 对组织器官缺损和功能障碍治疗起到了革命性变革的作用, 从而被广泛认可为21 世纪最具应用前景的治疗方法。组织工程也已成为全球公认的最具发展前景和意义的科学技术研究领域之一。 组织工程作为一门多学科交叉的新兴边缘学科不仅展示了重要的科学意义；而且有着巨大的社会效益，目前全球器官替代治疗费用已占总医疗费用的8%，价值约达3500 亿美元/年，因此组织工程可望产生丰厚的经济回报。组织工程自1987年正式提出以来，已成为各国科学家竞相进行研究和开发的热点，美国国家科学基金会先后资助建立了一系列组织工程实验室，并集中了相当数量的著名研究机构开展这方面的工作。日本政府对组织工程的研究也赋予了极大的重视, 2001 年组织工程已成为日本生物技术领域中仅次于基因分析的第二大科研投入项目。我国也已在上世纪末将组织工程列为国家973计划、863 计划以及国家及地方自然科学基金的重要研究项目。不仅如此，大量的私人公司对组织工程研究和开发投入重金，在目前已投入组织工程领域35 亿美元的资金中90% 以上来自于私人。 近年来，在各国大量投入的推动下，伴随着分子生物学、材料学和工程学的不断进步，组织工程学得到了空前的发展。在种子细胞的研究方面以骨髓间质干细胞为代表的成体干细胞和胚胎干细胞研究已取得了突出的进展；作为组织工程支架材料的可降解聚合物与无机生物活性纳米复合材料表现出了较好的综合性能；在临床方面，组织工程皮肤已被批准进行临床应用，组织工程骨临床实验也得到了一些较好的实验结果。因此可望在不久的将来, 组织工程化的各种组织和器官便可以问世, 人们就可从中受益, 使生活质量得到新的提高。组织工程包括三大要素，即种子细胞、支架材料和细胞生长因子。理想的细胞支架应具有一定的生物降解速度、良好的细胞亲和性、呈特定的三维多孔结构。 组织工程中细胞支架起着为细胞增殖营造环境的作用，它应随着细胞的繁殖而逐渐降解、消失，以利于将空间让位于细胞，并使所生成的组织和器官具有同细胞支架相同的几何形状。因此作为细胞支架的高分子材料必须具有生物降解性，即在生理或体内环境下组成材料的分子链能自动断裂，并由此形成的小分子能逐渐被机体代谢或吸收。此外，还要求材料的降解速度与细胞的增殖速度相匹配、以及由降解所形成的小分子不会对细胞繁殖产生不利的影响。因此组织工程的细胞支架材料必须具有生物降解性和一定的降解速度、良好的生物相容性及细胞亲和性。此外，组织工程的细胞支架，不仅应具有在细胞培养过程中能保持形状、不会破碎、可以操作的力学强度外，从临床应用出发，细胞支架还应具有一定的柔韧性，使之能够同机体组织相缝合、并能同机体组织贴合，也不会对机体组织造成机械损伤的力学性能。因此，作为组织工程细胞支架的生物材料必须兼具有生物可降解性、良好的生物相容性、细胞亲和性、一定的力学性能、可加工性，以及可消毒性等。[2-5] 组织工程用生物降解材料可分为天然降解材料、合成降解材料和复合材料。天然降解材料如羟基磷灰石、珊瑚礁和磷酸钙、壳聚糖、海藻酸盐、胶原蛋白、葡聚糖、透明质酸、明胶和琼脂等，它们的优点是具有特异性的分子识别功能、生物相容性好等, 缺点是存在力学强度较差、性能不稳定及因宿主酶环境变化而降解行为不好调节等。合成降解材料具有强度高、来源充足、易于加工等优点, 但通常又具有缺少内在的生物活性、降解产物有毒、可能引起植入部位微环境(如pH )发生变化等缺点; 此外, 在材料降解速度的可控性、强度、可注射性、组织相容性、细胞亲和性、可加工性及可消毒性等方面仍有许多问题有待解决。复合材料由于可以综合单一材料各自的优点, 弥补它们各自的一些缺点, 从而取长补短,因此成为开发新型组织工程材料的有效途径。
2. 聚乳酸类组织工程支架材料的种类 聚乳酸( PLA)是经FDA 批准的极少数可用于人体的可降解聚合物材料之一。PLA 在人体内代谢的最终产物是CO2 和H2O，中间产物乳酸也是体内正常糖代谢的产物，不会在重要器官聚集，因此具有优异的可生物降解吸收性。目前已经实用化的聚乳酸材料产品有缝合线、骨结合部位固定材料、组织缺损修复材料等。聚乳酸由于其良好的生物降解性、生物相容性和可加工性，已广泛应用到组织工程支架制备中。 同时，由于聚乳酸细胞亲和性差，疏水性较强，降解速度很慢，在体内长期存在容易引发炎症和肿胀并发症。因此，聚乳酸通常不单独作为组织工程支架材料，而是利用与其它单体的共聚、与其它聚合物共混，或者用天然高分子或天然无机物与聚乳酸共混或杂化的技术，通过控制材料的组分、组成比、分子量、分子量分布等手段,达到调节和控制材料性能的目的。现在聚乳酸类材料已有了物理性能由液态到固态、强度由弱到强、硬度由软到硬、生物降解速度(降解半衰期) 由几周至几年可供选择。[6-9]2.1 聚乳酸及其共聚物 聚乳酸共聚物是应用得最多的组织工程材料，聚乙醇酸(PGA ) 降解速度快并亲水性好,聚己内酯(PCL) 药物通透性优良, 通过单体共聚的方法可以得到聚(乙交酯/丙交酯) 共聚物(PLGA )、聚(己内酯/丙交酯) 共聚物(PLC)、聚(乙交酯/己内酯) 共聚物(PGC)、聚己内酯/聚丙交酯/聚乙二醇三元共聚物(PCEL )以及聚(乙交酯/丙交酯/己内酯)三元共聚物(PGLC)等一系列聚乳酸共聚物，这些材料广泛用于组织工程。[10] 聚氧化乙烯具有极好的生物相容性。这种高生物相容性被认为来源于高运动性和亲水性的PEO对吸附分子的阻抗作用。PLA与PEO结合制备的聚乳酸-聚氧化乙烯(PLA - PEO) 共聚物,可有效调节材料的物理机械和表面性能,制备理想的组织工程材料。 聚乳酸- 氨基酸共聚物是为适应组织工程要求而发展起来重要支架材料。一方面,聚氨基酸本身也具有良好的生物相容性和可生物降解性,其降解产物氨基酸对人体无毒害作用,而且氨基酸链段的引入,可以调节聚乳酸材料的降解性能；另一方面,氨基酸链段带有反应性的官能团侧基,如-NH2 , -COOH 等，可以用来固定具有生物活性的分子，如蛋白质、糖类、多肽等，可改善材料与细胞之间的相互作用。其中，聚乳酸-赖氨酸共聚物(PLAL) 是聚乳酸-氨基酸共聚物中研究最多的一类。2.2 聚乳酸复合材料 组织工程中所用的复合材料是由两种或两种以上不同材料优化组合而成的支架材料。羟基磷灰石(HA)/ PLA 复合材料是比较成功的复合材料，羟基磷灰石(Hydroxylapatite, HA ) 是自然骨的主要成分, 具有极好的生物活性。但它的脆性大、强度较低、易断裂。将HA 与PLA 类聚合物复合制成生物降解复合材料, 可以把两者的优点集于一体，使该复合材料既具有骨传导性又具有良好的力学性能,成为性能优异的骨组织工程材料。基于这一目的, 自90 年代初首先开始了HA/PLA骨折内固定复合材料方面的研究工作, 最近几年研究相当活跃, 研究内容涉及该复合材料的制备、机械性能、界面组织结构、生物相容性及生物降解行为等方面。同时聚乳酸与活性玻璃的研究报道也逐年增多，近几年对纳米材料或纳米复合材料的研究有了新的突破，这已成为组织工程支架材料研究的方向之一。[11] 生物活性有机成分/PLA复合材料在骨组织工程领域中使用的生物活性有机成分主要有磷酯、同种异体骨、异种骨、骨形成蛋白(粗提牛骨形成蛋白bBMP和基因重组人骨形成蛋白rhBM) 等, 众所周知, 这类物质具有高效骨诱导活性, 但是将它们单独植入生物体内时, 由于容易被生物体吸收而使其骨诱导活性难以得到充分发挥。所以, 近年来人们将这些生物活性有机成分与PLA进行复合制作骨修复材料, 探讨它们在骨修复过程中所起的作用。 聚乳酸(PLA) 及其衍生物也可以形成水凝胶组织工程材料。用一般固体材料所制备的细胞支架在应用过程中经常会因为需修复组织形状的不规范而需要医生在临床作精心的雕刻, 然后才能用此支架进行修复吻合工作, 造成了应用的极大不便。此外, 固体材料的棱角对组织可能造成的机械损伤也是不容疏忽的。由于水凝胶可以避免上述的缺陷, 因而开发可注射性水凝胶材料成为组织工程研究的又一热点。3. 聚乳酸类组织工程支架的制备方法[5,12] 在组织工程中，除了考虑材料的化学性质、表面性能外，还应考虑多孔三维细胞支架的结构，如孔隙形态、大小、连通性、孔隙率等，以利于细胞的黏附、渗透和营养物质的传送及代谢产物的交换，而支架的结构取决于三维支架制备方法。聚乳酸类组织工程材料可以采用多种方法制备具有合适体型结构的组织工程支架，包括：纤维粘接、溶液浇铸/粒子沥滤、气体发泡、相分离技术、快速成型技术等。3.1 纤维粘接 由PGA 或PLGA 纤维构成的骨架的优点是表面积大, 有利于细胞的粘附和养分的扩散, 故对细胞存活和生长有利; 缺点是内架结构稳定性不好。对此可加以改进。一种方法是纤维固定技术，如将PGA 纤维浸入到PLLA 的氯仿溶液中, 待溶剂挥发后, PGA 纤维网嵌入到PLLA 中，将混合物加热到两种聚合物的熔点以上，PLLA 首先熔融, 充满PGA 纤维网络所有空洞。PLA 的作用是稳定PGA纤维和防止PGA 开始熔融时纤维网络结构塌陷。经一定的热处理, 交叉点的PGA 纤维熔融后物理结合在一起, 选定一种只能溶解PLLA 的溶剂将其溶解, 即可得到高度多孔网状结构。采用这种成纤技术制得的多孔网状结构的孔隙率和孔直径分别高达81% 和500um。3.2 溶液浇铸/粒子沥滤 该技术是将聚合物(PLLA或PLGA)溶解在溶剂中, 然后将溶液浇铸到充满致孔剂的培养皿上。待溶剂挥发后, 将聚合物/盐混合物在水中沥滤去掉致孔剂, 从而得到不含粒子的聚合物骨架。骨架的孔隙率由所加盐的用量来控制, 孔的直径由盐晶粒的大小决定。当盐的重量百分比达到或超过70% 时, 孔与孔之间高度相互连通。3.3 熔融成型 该技术与粒子滤出类似，将PLGA 等粉末与明胶粒子混合物放在四氟乙烯模具中, 将模具加热到超过PLGA的玻璃化温度, 加压使PLGA 和明胶粒子结合在一起。冷却后将复合物放入水中, 明胶粒子溶解后得到PLGA 骨架。可通过改变明胶粒子的大小和明胶/PLGA 的比对孔结构加以控制。3.4 气体发泡 气体发泡技术采用气体作为致孔剂，方法是在加热模具中通过模压成型制备PGA、PLLA 或PLGA 固体片材。将这些固体片材置于高压CO 2 (515M Pa) 室内三天,然后使压力快速下降到大气压强, 使聚合物中形成气穴。所得支架的孔隙率高达93%。3.5 相分离法 相分离法又包括冻干法相分离法、热致相分离等。而且除了液液相分离外, 还有液固相分离。乳化/冷冻干燥方法是将PLA类聚合物溶于CH2Cl2后, 加入蒸馏水形成乳状液, 将聚合物/水混合物浇铸到模具中, 置于液氮中骤冷。然后将支架于- 55℃下冷冻干燥, 真空蒸发掉分散的水和聚合物溶剂。采用该技术制备的支架孔隙率高达95% , 但形成孔的直径很小。相分离得到的孔的形态也受许多参数影响,包括聚合物类型、聚合物溶液浓度及冷却速率等。3.6 热致凝胶化与其它方法结合制备纳米级纤维支架 纳米级纤维支架由聚合物溶夜经过热致凝胶化、溶剂交换和冷冻干燥过程制备。研究发现：在冷冻干燥前, 聚合物浓度、热退火、溶剂交换和冷冻温度对纳米级结构有影响。一般情况, 高凝胶化温度得到的为片晶状结构; 低凝胶化温度得到的是纳米级结构。采用该技术制备的骨架的孔隙率高达98% , 孔直径在50～500nm 范围内。3.7 聚合物微球聚集 微球聚集也可构成多孔骨架。骨架的孔隙率就是微球间的间隙, 它直接与微粒的直径相关。该技术的优点是微粒可包裹生长因子, 进行可控释放。3.8 一体化制备方法( 快速成型法) 快速成型技术又称固体自由成型技术,它采用离散/堆积成型原理，先由三维CAD 软件设计出三维曲面或实体模型，然后根据工艺要求，将其按一定厚度进行分层，把三维模型变为二维平面/ 截面信息，即离散的过程；再将分层后的数据进行一定的处理，加入加工参数，产生数控代码，在微机控制下数控系统以平面加工方式有序、连续地加工出每一个薄层，并使它们自动粘结而成型，即材料堆积的过程。其特征在于可同时完成致孔和外形的成型，一步得到具有一定外形的三维多孔支架。三维打印和熔融堆积成型是目前用于多孔支架制备的两个主要的快速成型方法。其它还有一些方法，如静电纺丝等等这里不一一叙述。
4. 聚乳酸类材料在组织工程中的应用 聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）及其共聚物(PLGA)和复合材料目前是应用最为广泛的组织工程支架材料，目前已在骨、软骨、肌腱、气管、皮肤、肝、心瓣、血管、角膜、胰及神经的组织工程中广泛应用。其中在以下几方面的研究较多，研究成果也比较显著。4.1 骨组织工程[13] 骨组织工程由于在临床应用上具有广阔的前景，始终都是组织工程的重点研究对象，经过近十年来的快速发展，目前已取得了初步的成果，证实了支架复合物上可以形成骨组织，从而实现体外构建组织工程骨的目标。近年来骨组织工程的研究逐渐集中到两个方面：一是细胞传输，具有细胞传输功能的物质主要有聚乳酸（Polylactide，PLA ）、聚乙醇酸（Polyglycolide, PGA）以及二者的共聚物(PLGA)等；二是骨组织诱导，如羟基磷灰石（HA）等生物活性陶瓷能引发成骨细胞及其他细胞吸附于支架上，随着基质堆积，骨组织逐渐形成，并重新塑形。现代材料加工技术制作的多孔状PLA 具备了模拟松质骨的三维立体构型,早期可产生局部压电效应,刺激生发层多能干细胞的分化及膜内、骨内成骨。同时,加入有骨传导作用的羟基磷灰石(HA) 、磷酸三钙(TCP) 及胶原等能大大提高材料的骨传导性,而多孔材料能良好承载如骨形成蛋白(BMP) 、碱性成纤维细胞因子(bFGF) 等生长因子，又使材料具备了骨诱导作用。软骨是组织工程学研究较多的重建组织，如用PLA 纤维网培养鼻软骨细胞, 所得到的新生组织的组织学表现与正常软骨相似。将软骨细胞种植于精确塑型的聚乳酸共聚物材料上并植入裸鼠体内可以形成与人耳形态相似的软骨组织，研究发现软骨细胞生长存在形状依赖性,可以通过改变生物材料的形态来控制新生组织的形态, 非常有利于今后的临床应用。聚乳酸类聚合物不仅在组织工程软骨的构建方面有大量的研究，而且在组织工程化骨、组织工程肌腱的构建和组织工程化周围神经的构建等方面有大量的应用成果。国内外的研究工作已证明了羟基磷灰石粒子同聚乳酸复合能得到力学性能较好、降解速率可调的骨修复材料，用细胞和支架材料复合培养以及体外构建组织工程骨，检测细胞的各种生物学性能和体外成骨能力，并将构建的组织工程骨移植到动物体内进行动物临床实验是骨组织工程今后重要的研究方向。随着PLA 及其复合材料的不断发展, 在骨科领域中将是一种极有前途的骨组织工程细胞生长载体材料。4.2 皮肤组织 目前，在皮肤创伤修复过程中，应用的真皮替代物主要有异体真皮、无细胞真皮基质和合成真皮基质等。但以上真皮替代物由于免疫反应、缺乏活细胞或支架材料难以塑性等缺点而未能得到广泛的应用。组织工程真皮被认为是大面积皮肤修复最理想的材料，组织工程皮肤材料也是目前唯一已经商业化的组织工程材料。它的构建思路是利用生物学和工程学原理研究、开发用于修复、维持和改善损伤的真皮组织。具体的方法是将体外培养的真皮成纤维细胞与适当的胞外基质相结合,然后将其移植到病损部位。对于皮肤组织工程来说，一种在生物相容性、空间结构、机械强度等方面均有利于组织重建的、理想的组织工程支架材料非常重要。多孔的聚乳酸海绵材料和聚乳酸纤维材料是较为理想的人工真皮支架材料，已经在人工真皮构建中起到重要的作用。如Advanced Tissue Sciences 公司生产的真皮替代物Dermagraft 即是由新生儿成纤维细胞种植在可降解的聚乳酸纤维网上组成,现已成功用于治疗糖尿病性溃疡。多孔的海绵状聚乳酸支架材料具有较大的表面积和高孔隙率,利于细胞的粘附和营养物质的传递及代谢产物的交换,可以更加充分地发挥其组织再生的潜力。4.3 血管组织 血管组织工程的主要内容是体外构建自体血管。在呈多微孔状态的可降解聚合物生物支架材料（主要是PLGA）上植入自体血管壁细胞(包括平滑肌细胞和内皮细胞)，经体外培育后植入机体，随着聚合物支架材料逐渐降解吸收，可建立自体血管。按这种方法获得的血管可以根据需要制成不同大小的口径，而且移植后具有生长潜能，因而，对婴幼儿来说尤为适宜。实验者曾把绵羊的颈动脉细胞先后种植于PGLA 上,一周后进行绵羊主肺动脉置换术,即用体外构建的血管置换原主肺动脉。组织学检测显示，移植2周后，PGLA 已完全消失。4-羟脯氨酸生化检测显示移植血管壁含70%胶原，与正常血管相似。移植10～12周后,亦无明显血栓形成和钙化的迹象。
论文来源：1st International Conference on Technology and Application of Biodegradable Polymers and Plastics,October,2004 |
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