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初代脾臟淋巴細胞對高分子-PHA 聚合物與摻合物之生物相容性評估 |
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| 初代脾臟淋巴細胞對高分子-PHA 聚合物與摻合物之生物相容性評估 |
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暂无
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| 关键词： |
脾臟 淋巴 細胞對 高分子 PHA 聚合物 與摻
生物 相容性 |
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功能高分子 |
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来源网络 |
| 简介： |
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尤明村、呂昀、周秀慧輔仁大學生命科學系（台湾）
一、中文摘要 环境中微生物合成之聚羟基酯类 (polyhydroxyalkanoates; PHA)聚合物具有”生物分解性”、生物兼容性”及”生物适用性”的特质而成为目前最热门的塑料取代者。发展PHA 材料成为塑料取代物的同时，PHA 高分子材料可研发成为高价值的生医材料以供生物工程和生物医学的应用。本计划的目的是藉由体外免疫初代细胞测试系统评估对PHA 聚合物材料对细胞是否具毒性以及是否影响免疫反应，来评估PHB 或PHBV 生物兼容性和应用安全性。实验的方法是将不同浓度PHB 或PHBV 的悬浮液与脾脏制备的初代细胞作不同时段的共同培养。实验结果显示 PHBV 不会影响脾脏初代细胞对T 或B 淋巴球分裂原的增殖反应。而PHB 却随浓度增加会抑制Con A 对脾脏T 淋巴球的增殖作用。另外，PHB 会增加脾脏初代细胞对NO 的释放，并且PHB 可抑制LPS 对脾脏初代细胞在IL-1α、IL-6 和TNF-α的产生。另外以PHB 或PHBV 制成之薄膜植入老鼠背部皮下的结果显示，PHB 或PHBV 不具毒性，也不会造成植入区周边皮膜和毛发的异常，此结果显示PHB 具生物兼容性与医用安全性。二、简介 发展”生物分解性塑料材料” 是目前发展生物可分解性的原料时，这些原料多半为一种生物高分子材料，具生物分解性(biodegradable)、生物吸收性(bioabsorbable)、甚至具生物兼容性(biocompatible)。因而在研发为”生物分解性塑料材料”同时，利用生物高分子材料的特质可同时开发具有安全性的生医材料作为生物工程和临床医学之用。生物吸收性高分子材料应用产品可运用在外科缝合线，组织修补材料及药物释放控制等方面，配合各种药物，营养素及生长激素等，在疾病的预防/治疗与生物科技之应用非常宽广，因此非常值得投入研究与开发。 微生物合成之聚羟基酯类(polyhydroxyalkanoates,PHA)为一种天然生物合成高分子材料，目前主要是以 Ralstonia eutropha (以前称为Alcaligenes eutrophus)菌种在喜氧状态下，以醣类酦酵所得到的聚酯。近年来以PHA 的高分子聚合材料可用于医学材料的研发例如drug delivery system 中的发放器(Pouton and Akhtar 1996)，另应用有药品、杀虫剂、除草剂、肥料、拋弃式物品、外科缝合材料，骨骼取代品、骨板、血管置换物。这些材料搭配各种药物制成营养素及生长激素，在疾病预防治疗与生物科技之应用非常宽广。近年来，以高分子材料配合生物医学的研究和技术已在组织工程学(tissue engineering)上广泛的被使用，而PHA 的研发成功将可以配合医工的发展，这会是未来科技的趋势。有关哺乳动物对植体生物兼容性的评估，主要是受体的免疫系统是否对植入物产生免疫排斥反应(Graft rejection) ， 植体免疫系统排斥反应主要包括非专一性 (non-specific)和专一性(specific)两种免疫反应。因PHB 在活体外可水解成D-(-)3-hydrobutyric acid 的单元体， 而 D-(-)-3-hydroxybutyric acid 是ketogenesis 代谢中所得到的 keto body 产物，此产物普遍存在高等动物的身体中。近日研究数据显示，一个100-200 单元体所组合的低分子量 P(3HB)高分子，普遍存在原核和真核细胞膜上，可作为ion channel 的基本组成(Rensch et al, 1988a ,1992)。另外，P(3HB) 的含量可在人类的血液中侦测到，也是人类代谢的分解产物之一(Rensch et al, 1992)。基于以上种种，因而推测PHB 是具有生物兼容性，可应用在各种植体、植片、胶片等生医材料的制作(Reusch et al, 1992)而不应具有毒性。然而PHA 在活体的植入研究结果并不一致，首先根据活体外的方式评估 PHB 兼容性研究指出，以小鼠纤维母细胞或仓鼠卵巢细胞 (CHO-k1)与PHB 片混合培养，并不会改变二种细胞生长和小鼠纤维母细胞中葡萄糖消耗与乳酸的产生(Lafferty et al, 1988; Pouton et al, 1988)。但以PHB 和PHV 聚合物制成的导管植入猪的冠状动脉之实验结果显示，PHBV 植入四周后会导致严重的发炎反应，周围纤维细胞增生及血管壁增厚的现象(van der Giessen et al, 1996)。另外以PHB 或PHB/VA 植入小鼠实验结果显示，PHB 掺合Hydroxyvalerate 或Valerate 时可造成受体植入物的急性发炎反应(Gogolewski et al, 1993)，显示PHB 及其聚合物在生物体的兼容性仍需进一步确认，尤其以PHA 混合其它聚合物作掺合时，生物兼容性一定要准确评估以确保PHA 的医用安全性。三、实验 1. PHA 复合物、PHA 掺合物和植入物(Implant) 准备 此实验所需PHA 单元体与复合物将自美国 Sigma-Aldrich 公司并保存于desiccators 中。PHA 和PHBV 植入体约2×15 mm 盘状或4×7 mm 之柱状(size 将依实验条件做修正)先用hexane 处理去除不纯之杂质， 再以真空抽干并置于70% 酒精中作灭菌处理。2.脾脏组织的收集和细胞悬浮液之备制 新鲜细胞悬浮液的备制根据Chou et al(1996)之方法。实验小白鼠先以乙醚麻醉后，由心脏抽取约1ml 血液，新鲜的脾脏由老鼠体内取出，利用无菌的磨砂玻片将脾脏、胸腺和淋巴结制成单一细胞悬浮液，细胞液于试管中静置5 分钟，取上清液转入新管并离心（1500rpm，5 分钟，4℃），保留细胞pellet 再与cold lysing buffer 作用3 分钟以溶解红血球，尔后以培养液终止红血球溶解作用并尽速离心，清洗细胞2 次，以EtBr / AO 染色并于萤光显微镜下计数细胞，最后将脾脏细胞液稀释成5x106 cells/ml 待用。3 . 实验动物 本研究所使用之脾脏初代细胞和活体实验动物主要来自纯系SPF（specific pathogen free）雄性BALB/c 小鼠，出生8-10 周，体重约20 克重，自国家实验动物中心购得，动物抵达后会被安置于一间干净安静的房间内饲养，并有人工调控光照周期，日夜各12 小时。温度（25℃）与湿度（60-70%）均适度监控中，食物和饮水会按时供给与更换。动物的操作会依照标准实验动物操作法来执行。动物的管理与饲养参考 Guide for care and use of laboratory（ILAR，1996）规则办法施行。4. PHA 生医材料植入实验 将实验小鼠分成三组：控制组、手术控制组和实验组。实验组将依植入物（PHB 和PHBV）之来源与制作再细分成几个小组，每组动物只数为10~12 只，手术时，动物以 70mg/kg Pento-barbital (Sigma , USA )。腹腔注射麻醉， PHB 的薄膜植入前以70%酒精浸泡2 小时，再以无菌PBS 浸润之后才植入手术部位，植入的皮肤先剃除毛发并以6% chlorhexidine 消毒溶液清洗，植入后伤口用含有抗生素的不沾敷料覆盖并以弹性绷带固定，手术后10~14 天拆除敷料，每个时段每组动物牺牲5~6 只，取得免疫组织与PHB 植入组织做进一步免疫功能的测定。5. 细胞增殖活性分析（Mitogen Proliferation Assay） 自BALB/c 小鼠取得的新鲜脾脏及胸腺，各经玻片研磨后形成单一悬浮细胞液备用。备制实验所需的PHB 悬浮液（0-100μg/ml）、分裂原Con A（0-6μg/ml）及LPS（0-10 μg/ml）浓度并分别与5x105 cells 脾脏免疫细胞作用共同培养48 小时（37℃、5%CO2）。细胞增殖的反应结果将以MTT 测定法测定（Gerler et al., 1986），实验结果以%控制组细胞值表示。6. 细胞激素含量之定量分析（Cytokine Quantitation）样本中IL-1、IL-6 与TNF-α 的含量主要是利用R & D system 的Duoset ELISA Development Kit 作测定，实验操作依kit 所提供的流程完成，如今简述如下：培养盘上每孔加入100 ul 已稀释的capture antibody，室温下培养2 小时，以 washing buffer 洗去未贴附的抗体，加入300ul 的blocking buffer 并于室温下培养2 小时，以washing buffer 洗去残余的溶液，加入100ul 的细胞上清液或细胞激素标准品溶液，室温培养1 小时后亦以washing buffer 去除细胞上清液或标准品溶液，再加入100ul 的biotinylated goat anti-mouse Ab，室温培养2 小时，以washing buffer 洗去未贴附的抗体，再加入100ul 的streptavidin-HRP，室温培养20 分钟后去除多余的substrate，加入100ul 的substrate solution，室温下避光培养15-20 分钟，以2N H2SO4 停止反应，测定波长450nm 的吸光值。所得之吸光值对照标准曲线求细胞激素的相对浓度。7. 肿瘤坏死因子定性之测定（TNF Bio-Assay） 实验进行前2-3 天，将L929 细胞株由25T 培养皿转入 75T 培养皿中大量培养，待L929 细胞株于培养皿中形成单层细胞后才开始进行实验。实验进行的第一天，收集培养皿中log 生长期的细胞并离心（1500rpm，10 分钟），将细胞稀释成2.5x105/ml，取100μl/well 的细胞加入96 孔培养盘中，于37℃、5%CO2 培养箱中培养18-24 小时。第二天，确定培养盘中的细胞已形成单层细胞后，先加入10μl/well Actinomycin-D（60μg/ml）抑制L929 细胞的增殖作用，再分别将待测的细胞上清液或TNF 标准品（0-100U/ml）加入，继续培养24 小时。第三天，以PBS 去除培养盘之上清液及未贴附的细胞，再加入50μl/well stain solution（20% formalin + 0.2% crystal violet）于室温中作用20 分钟，以自来水浸泡培养盘数次，去除多余的染液，风干。第四天，加入100μl/well PBS/Ethanol solution（1：1）溶解细胞，测定波长570nm 吸光值，所得之吸光值对照标准曲线求TNF 浓度。8. 一氧化氮浓度分析（Nitric Oxide Assay）免疫细胞与PHB、PHBV 或分裂原培养后所得的上清液中内含细胞释放的一氧化氮，由于NO 在空气中极不稳定易转变为Nitrite 与Nitrate，因此此法是测定样本中nitrite 的含量来评估NO 之含量。Nitrite 的浓度主要是利用NaNO2 作出Nrtrite 的标准曲线，以取得溶液中的NO/Nitrite 相对浓度。首先2mM NaNO2 以PBS 等量稀释成0-100μM，Griess A 及B 等量混合形成Griess reagent，操作前将100μl/well Griess reagent 与NaNO2 或上清液混合作用10 分钟，测定波长550nm 的吸光值，所得的溶液吸光值对照标准曲线可决定Nitrite 的浓度（Stuehr ＆Nathan, 1989）。四、结果与讨论生物高分子材料制成的产品早已被广泛的应用在生医材料、医药品、化妆品、食品、化工原料及研究等用途上，并且有逐年增加的趋势。高分子—PHA 是一种由微生物合成之天然高分子，在商业界早已普遍用在日常用品容器或器具之材质，在医学界，部分PHA 材料已结合其它生医材料，用在长期药物的携带设计、药品、外科缝合材料，骨骼取代品、骨板和血管置换物等。 生物相关性（Biocompatibility）是评估植入物与受体互动的观察，当受体的细胞群感受到植入体存在时，细胞生长曲线和模式会因此植入物的材质作条件式的调整，如果植入物的化学结构差异度较大者，会影响受体细胞的活性和正常功能的表现。来自新鲜组织的初代细胞不仅可真实反应活体细胞之生理作用，对接下来活体实验得评估具连续性和整体性。本研究为了验证细胞株实验之真实性，将取自小鼠脾脏和胸腺组织制成单一悬浮细胞，分别与高分子—PHB 或PHBV 作培养。研究材料是以购自美国Sigma-Aldrich 的PHB 或PHBV 进行测试，研究结果显示高分子—PHBV 对脾脏细胞不具毒性也不会影响增殖反应，并且PHBV 也不会影响T 淋巴球分裂原（Con A）和B 淋巴球分裂原（LPS）对脾脏初代细胞活化增殖的作用（图一和图二），但PHB 却随浓度增加会抑制Con A 对脾脏T 淋巴球的增殖作用（图一和图二）。 淋巴球在抗原之存在下也会释放NO，NO 是一种讯号分子，可作用在不同目标细胞中，调控许多细胞死亡与增生之讯号反应，而过高的NO 反而会抑制淋巴球之增殖作用，实验结果显示（图三B），高分子—PHBV 不会处进促LPS 刺激脾脏B 淋巴球和巨噬细胞对NO 的产生。但PHB 和PHBV 却会增加培养液中Con A 刺激脾脏T 淋巴球对NO 的产生（图三）。另外，Con A 和LPS 可以引发脾脏细胞中T、B 淋巴球和吞噬细胞活化而增殖，进而刺激其产生细胞激素。研究细胞激素结果显示（图四），在LPS 刺激下，培养液中加入高分子 PHB 会显著抑制脾脏初代细胞对IL-1β、IL-6 和TNF- α的产生（图四）。我们也以生物活性测验（Bioassay）对PHB 处理后细胞所产生之TNF 的活性（数据未显示）作评估，结果显示，高分子PHB 不仅可造成初代淋巴细胞对TNF 制作量的减少，也会影响TNF 毒杀L929 细胞的活性表现（图五）。根据此研究的结果建议PHB 虽不会显著影响分裂原活化之淋巴球的增生，但却显示 PHB 对T 淋巴细胞的活性会有影响。甚至可能造成细胞失去正常功能。 为了增加实验的准确度，加上PHB 在体内分解须长时间，因此我们须作更长期的观察，我们委托淡江大学董崇民老师将PHB 聚合物和PHBV 掺合物制作成薄膜(0.9 x 0.7x 0.02 cm 大小)，以进行植入小鼠背部皮下实验；经过六个月评估显示PHB 和PHBV 的植入，并不会造成植入区域和邻近组织的病变，初期3 个月在植入周围有白血球聚集，但此现象为短期，随着伤口愈合，白血球聚集现象也随着消失，并且植入区域皮膜和毛发生长正常（图六），此结果显示PHB 和PHBV 生物兼容性颇高，因而未来决定进行整体活体植入评估试验。五、参考文献 1.Chou, S.H., Kojic, L.D., Nordyke-Messingham, K. and Cunnick, J.E. (1996) Characterization of the effect of 2-deoxy-D-glucose (2-DG) on the immune system. Brain. Behav. Immun. 10, 399-416. 2. Gerlier, D. and Thomasset, N. (1986) Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. J. Immunol. Meth. 94: 57-63. 3. Gogolewski S, Jovanovic M, Perren SM et al., (1993) Tissue response and in vivo degradation of selected polyhydroxyacids: polylactides (PLA), poly(3-hydroxybutyrate)(PHB), and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHB/VA). J Biomed Mater Res, 27(9): 1135-48. 4. Lafferty RM et al. (1988) Microbial production of poly-3-hydroxybutyric acid. In: H.J. Rehm and G reed (Eds). Biotechnology: a comprehensive treatise, Special Microbial processes, VCH Verlagsgesellschaft, Weinhheim, vol6b, p135-176. 5. Pouton CW and Akhtar S (1996)Biosynthetic Polyhydroxyalkanoates and their potential in drug delivery. Advanced Drug Delivery Review, 18: 133-162.6. Rensch RN and Sadoff HL (1988a) Putative structure and function of a poly-β-hydroxybutyrate/calcium polyphosphate channel in bacterial plasma memebranes. Proc. Natl. Acad. Sci, 85:4176-4180. 7. Rensch RN et al., (1992) Transport of poly-β -hydroxybutyrate in human plasma. Biochim. Biophys. Acta 1123: 33-40. 8.Stuehr, D., & Nathan, C. (1989) Nitric oxide: a macrophage product responsible for cytosis and respiratory inhibition in tumor target cells. J. Exp. Med. 169, 1543-1555. 9. van der Giessen WJ, Lincoff AM et al., (1993) Marked inflammatory squelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation, Oct, 94(7):1690-7 2004年全国高分子材料科学与工程研讨会论文集 |
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2005-06-27 10:07:46 |
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