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东华大学洪枫教授团队《Int. J. Biol. Macromol.》:弹性丝光化细菌纳米纤维素/聚乙烯醇复合小口径人工血管
2023-08-28  来源:高分子科技

  细菌纳米纤维素(Bacterial nanocelluloseBNC)管在小口径人工血管领域具有极大的应用潜力,然而水凝胶态下,力学性能弱、缝合强力较低顺应性不足等问题,也一定程度上限制了BNC管的应用。虽然目前可以通过浓碱处理来制备丝光化BNCMercerized BNCMBNC)以提升BNC管的力学性能,但是其缝合强力仍然较低,弹性较差,这使得BNCMBNC管的手术操作变得相对困难。因此东华大学洪枫教授团队结合了浓碱处理技术和水溶性弹性高分子材料聚乙烯醇(Polyvinyl alcoholPVA)的冷冻相分离技术,制备了具有弹性的丝光化BNC/PVA复合小口径人工血管(MBP),评估了其应用潜力。该成果以Production of novel elastic bacterial nanocellulose/polyvinyl alcohol conduits via mercerization and phase separation for small-caliber vascular grafts application为题,发表于International Journal of Biological Macromolecules上。


1 ABNCMBNCMBP管的宏观形貌图;(BBNCMBNCMBP管的宏观截面图;(C文章设计概念图

聚乙烯醇的引入——丝光化BNC/PVA复合管结构与物理性能的变化


  图2A和图2B分别显示了BNCMBNCMBP管的内表面和外表面的微观形貌。BNCMBNC管为纤维结构,而对于MBP管而言,所有的MBP管的内表面和外表面均为多孔结构。与MBP-12.5相比,MBP-10MBP-15的内表面虽然有大量的多孔结构,也有更多的不规则块状结构或条状结构,而这三种管的外表面都相对均匀。PVA溶液的黏度随PVA溶液浓度的增加而提高,而黏度的高低会影响到BNC体积收缩和PVA的沉积过程因此,MBP管内外表面的差异可能归因于不同浓度PVA溶液的黏度差异。 


2 BNCMBNCMBP管的微观形貌(FE-SEM):(A)内表面;(B)外表面。


  由于PVA会在碱溶液中发生沉淀,因此PVABNC网络中的沉积在一定程度上抑制了丝光化过程中BNC的体积收缩。所以,与MBNC相比,MBP管的体积收缩率更低(见图3B)。样品的持水量如图3C所示,BNC的持水量为197.66 mL/g,远高于MBNCMBP,由于丝光处理和PVA的引入,MBNCMBP管持水能力下降


  与BNC相比,MBP管的轴向杨氏模量径向拉伸强度和爆破压力随着PVA含量的增加而提高,但其数值仍低于MBNC管(见图3D、图3E和图3H)。此外,3FBNCMBNCMBP管的应力应变曲线PVA的引入改变了其力学拉伸特性,并且MBP管也具有远高于BNCMBNC的缝合强力,并随着PVA含量的增加而提高(图3G,变得利于手术操作。


  样品的表面孔隙率由于PVA的沉淀发生变化(图3G),BNCMBNCMBP-10MBP-12.5MBP-15的表面孔隙率分别为18.88%5.54%16.16%13.16%11.34%,进一步说明PVA在纤维中的沉淀抑制了BNC的丝光化进程。 


3 BNCMBNCMBP管的物理化学性质:(A)傅里叶全反射红外光谱;(B)体积收缩率;(C)持水量;(D)轴向杨氏模量;(E)径向拉伸强度;(F)应力-应变曲线;(G)缝合强力;(H)爆破压;(I)表面孔隙率。*代表0.01<p<0.05**代表p<0.01#代表无显著性差异p>0.05


  该研究MBP管分别进行了100次的循环应力试验和循环蠕变-恢复试验以确定其径向回弹性能,径向回弹性能的测定数据可以代表MBP管承受反复压缩时的回弹性能和耐久性能(图4)。循环蠕变-恢复试验表明,MBP导管能够承受严重压缩,并快速恢复到其原始形状,表明其具有良好的抗机械压缩性和耐久性。应力循环试验也证实了各样品的循环应变曲线具有一致性,没有发生明显的漂移。径向回弹试验的高重复性表明,MBP管在施加外力的重复压缩过程中,可以快速恢复其原始形状 


MBP管的循环蠕变-恢复试验:(A)力-应变曲线和(B)应变-时间曲线;(CMBP管的循环应力保持试验(黑线:力-时间曲线红线:应变-时间曲线)。


体外生物相容性的评估


  图5ABNCMBNCMBP管的BSA蛋白吸附量结果。BNC的蛋白吸附量最高,为59.53 μg/cm2MBNCMBP-10MBP-12.5MBP-15上的BSA吸附量分别为5.30 μg/cm221.68 μg/cm214.56 μg/cm25.31 μg/cm2,均显著低于BNC的蛋白吸附量。根据ISO 10993-4:2002,血液接触类医疗器械的溶血率应低于5%。图5B的溶血率结果显示BNCMBNCMBP管的溶血率均低于0.25%,说明不会造成溶血,符合相关标准。


  图5CBNCMBNCMBP管的血浆复钙动力曲线。MBNC管吸光度到达最大吸光度的时间比其他样品更长,这表明MBNC具有最长的血浆复钙时间。此外,BNCPVA膜和MBP导管的血浆复钙动力曲线没有明显的差异,说明其血浆复钙时间相近,说明将PVA引入到BNC三维网络中的丝光化过程不会进一步激活血液的内源性凝血过程。 


5 BNCMBNCMBP管的血液相容性:(A)蛋白吸附量;(B)溶血率;(C)血浆复钙动力曲线;(D)全血凝固时间。(PVA膜作为对照)**代表p<0.01


  全血凝固实验的结果如图5D所示,在全血凝固实验的终点PVAOD值高于BNCMBNCMBP,其原因可能在于BNC基人工血管表面的纤维和多孔结构可能可以吸附更多的蛋白质。此外,需要特别注意的是,在与血液接触35分钟内,MBNCMBP管在OD540的吸光度均高于BNC,表明在与血液接触的一段时间内MBNCMBP管上的血液比BNC管凝固得更慢。


  样品的血小板粘附情况如图6所示,本实验采用的富血小板血浆分离自兔动脉血MBNC表面的血小板粘附量最少,PVA膜次之,而BNC则具有最多的血小板粘附量。对MBP管而言,MBP管管腔的血小板粘附量低于BNC,且随着PVA溶液浓度的提高而下降,但其粘附量仍高于MBNCBNCMBNCMBP管内表面的血小板粘附量数据与表面孔隙率数据相匹配,说明更加紧密的表面结构和更低蛋白吸附水平可以显著降低血小板的粘附量。 


6 BNCMBNCMBP管内表面的血小板粘附量(PVA膜作为对照)


  根据ISO 10993-12:2021的相关标准,采用共培养法所测定HUVECs细胞存活率来测定BNCMBNCMBP的细胞毒性。图7A为共培养法所得HUVECs的细胞存活率细胞存活率均高于80%无明显细胞毒性。


  图7BHUVECs在样品内表面的增殖情况。在5天的培养时间内,BNCMBNCMBP管和PVACCK-8测定值均有所提高,表明所有样品都可以支持HUVECs的增殖。 


7 BNCMBNCMBP管的细胞相容性:(A)共培养法所得HUVECs的细胞存活率;(BHUVEC的在样品内表面的增殖情况。*代表0.01<p<0.05**代表p<0.01#代表无显著性差异p>0.05


MBP管的体内功效评估——SD大鼠腹主动脉移植实验


  用MBP-12.5小径管替换SD大鼠的部分腹主动脉以详细评估其体内生物相容性。图8ASD大鼠腹主动脉移植实验的示意图以及多普勒超声图像结果。其结果显示,在植入1周、4周、8周、12周、16周、20周和32周这几个时间点,MBP-12.5管腔内可以观察到正常的血流信号,血流正常,表明MBP-12.5在腹主动脉移植后保持了相对满意的远期通畅率。


  在MBP-12.5替换腹主动脉32周后,以SD大鼠的自体血管为对照用组织学染色和免疫荧光染色研究MBP-12.5的组织形成情况。图8BMBP-12.5替换腹主动脉32周的组织学染色和免疫荧光染色结果,其中自体血管的横截面被称为ControlMBP-12.5管中段的横截面被称为Cross sectionMBP-12.5管的轴向横截面被称为Axial sectionMBP管与自体血管吻合处的横截面被称为Anastomosis,以研究植入的效果(图8B)。图8B中的红色荧光(CD31)为内皮细胞,绿色荧光(α-SMA)为平滑肌细胞,蓝色荧光(DAPI)为细胞核样品中段横截面(Cross section血管吻合处横截面(Anastomosis样品轴向横截面(Axial section中均可观察到内皮细胞的红色荧光、平滑肌细胞的绿色荧光及细胞核的蓝色荧光,表明MBP-12.5管腔的内部形成了内皮层,并且在内皮层的下方有平滑肌细胞生成。ControlCD31的荧光比其他样本中的荧光更亮、更清晰,这意味着MBP-12.5的管腔内部虽然有内皮层的再生,但是内皮层的再生效果可能并没有自体血管好。此外,组织学染色结果H&E以及Masson也与免疫荧光的结果相对应。


  BNC的可控丝光化处理技术和PVA的冷冻相分离技术,最终获得丝光化BNC/PVA小口径复合人工血管(MBP)。MBP管不仅弹性好,具有良好的抗机械压缩性和耐久性,并且缝合强力有所提升,体外生物相容性良好。将MBP-12.5用于SD大鼠腹主动脉替换32周后,其管腔内部血流通畅并且其管腔内壁形成了内皮层和平滑肌层,具有较好的远期通畅率和组织相容性。 


AMBP-12.5的植入示意图以及其植入后1-32周的多普勒彩超;(BMBP-12.5植入32周的免疫荧光染色结果、HE染色结果和Masson染色结果(每组黄色和红色框内的放大结果均在其下方显示)


  论文第一作者为东华大学生物与医学工程学院博士生胡高铨,通讯作者为细菌纳米纤维制造及复合技术科研基地的洪枫研究员。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金和东华大学博士研究生创新基金的资助。


  全文下载链接:https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.124221

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(责任编辑:xu)
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