细菌纳米纤维素(Bacterial nanocellulose,BNC)管在小口径人工血管领域具有极大的应用潜力,然而水凝胶态下,力学性能弱、缝合强力较低和顺应性不足等问题,也一定程度上限制了BNC管的应用。虽然目前可以通过浓碱处理来制备丝光化BNC(Mercerized BNC,MBNC)以提升BNC管的力学性能,但是其缝合强力仍然较低,弹性较差,这使得BNC及MBNC管的手术操作变得相对困难。因此,东华大学洪枫教授团队结合了浓碱处理技术和水溶性弹性高分子材料聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,PVA)的冷冻相分离技术,制备了具有弹性的丝光化BNC/PVA复合小口径人工血管(MBP),评估了其应用潜力。该成果以Production of novel elastic bacterial nanocellulose/polyvinyl alcohol conduits via mercerization and phase separation for small-caliber vascular grafts application为题,发表于International Journal of Biological Macromolecules上。
图1 (A)BNC、MBNC和MBP管的宏观形貌图;(B)BNC、MBNC和MBP管的宏观截面图;(C)文章设计概念图
聚乙烯醇的引入——丝光化BNC/PVA复合管结构与物理性能的变化
图2 BNC、MBNC和MBP管的微观形貌(FE-SEM):(A)内表面;(B)外表面。
由于PVA会在碱溶液中发生沉淀,因此PVA在BNC网络中的沉积在一定程度上抑制了丝光化过程中BNC的体积收缩。所以,与MBNC相比,MBP管的体积收缩率更低(见图3B)。样品的持水量如图3C所示,BNC的持水量为197.66 mL/g,远高于MBNC和MBP管,由于丝光处理和PVA的引入,MBNC和MBP管持水能力下降。
与BNC相比,MBP管的轴向杨氏模量、径向拉伸强度和爆破压力随着PVA含量的增加而提高,但其数值仍低于MBNC管(见图3D、图3E和图3H)。此外,图3F为BNC、MBNC和MBP管的应力应变曲线,PVA的引入改变了其力学拉伸特性,并且MBP管也具有远高于BNC和MBNC的缝合强力,并随着PVA含量的增加而提高(图3G),变得利于手术操作。
图3 BNC、MBNC和MBP管的物理化学性质:(A)傅里叶全反射红外光谱;(B)体积收缩率;(C)持水量;(D)轴向杨氏模量;(E)径向拉伸强度;(F)应力-应变曲线;(G)缝合强力;(H)爆破压;(I)表面孔隙率。*代表0.01<p<0.05,**代表p<0.01,#代表无显著性差异p>0.05
图4 MBP管的循环蠕变-恢复试验:(A)力-应变曲线和(B)应变-时间曲线;(C)MBP管的循环应力保持试验(黑线:力-时间曲线;红线:应变-时间曲线)。
体外生物相容性的评估
图5A为BNC、MBNC和MBP管的BSA蛋白吸附量结果。BNC的蛋白吸附量最高,为59.53 μg/cm2,MBNC、MBP-10、MBP-12.5和MBP-15上的BSA吸附量分别为5.30 μg/cm2、21.68 μg/cm2、14.56 μg/cm2和5.31 μg/cm2,均显著低于BNC的蛋白吸附量。根据ISO 10993-4:2002,血液接触类医疗器械的溶血率应低于5%。图5B的溶血率结果显示BNC、MBNC和MBP管的溶血率均低于0.25%,说明其不会造成溶血,符合相关标准。
图5 BNC、MBNC和MBP管的血液相容性:(A)蛋白吸附量;(B)溶血率;(C)血浆复钙动力曲线;(D)全血凝固时间。(PVA膜作为对照)**代表p<0.01
全血凝固实验的结果如图5D所示,在全血凝固实验的终点PVA膜的OD值高于于BNC、MBNC和MBP管,其原因可能在于BNC基人工血管表面的纤维和多孔结构可能可以吸附更多的蛋白质。此外,需要特别注意的是,在与血液接触35分钟内,MBNC和MBP管在OD540的吸光度均高于BNC,表明在与血液接触的一段时间内MBNC和MBP管上的血液比BNC管凝固得更慢。
图6 BNC、MBNC和MBP管内表面的血小板粘附量(PVA膜作为对照)
根据ISO 10993-12:2021的相关标准,采用共培养法所测定HUVECs细胞存活率来测定BNC、MBNC和MBP管材的细胞毒性。图7A为共培养法所得HUVECs的细胞存活率,细胞存活率均高于80%,无明显细胞毒性。
图7 BNC、MBNC和MBP管的细胞相容性:(A)共培养法所得HUVECs的细胞存活率;(B)HUVEC的在样品内表面的增殖情况。*代表0.01<p<0.05,**代表p<0.01,#代表无显著性差异p>0.05
MBP管的体内功效评估——SD大鼠腹主动脉移植实验
用MBP-12.5小径管替换SD大鼠的部分腹主动脉以详细评估其体内生物相容性。图8A为SD大鼠腹主动脉移植实验的示意图以及多普勒超声图像结果。其结果显示,在植入1周、4周、8周、12周、16周、20周和32周这几个时间点,MBP-12.5管腔内可以观察到正常的血流信号,血流正常,表明MBP-12.5在腹主动脉移植后保持了相对满意的远期通畅率。
在MBP-12.5替换腹主动脉32周后,以SD大鼠的自体血管为对照,用组织学染色和免疫荧光染色研究MBP-12.5上的组织形成情况。图8B为MBP-12.5替换腹主动脉32周的组织学染色和免疫荧光染色结果,其中自体血管的横截面被称为Control,MBP-12.5管中段的横截面被称为Cross section,MBP-12.5管的轴向横截面被称为Axial section,MBP管与自体血管吻合处的横截面被称为Anastomosis,以研究植入的效果(图8B)。图8B中的红色荧光(CD31)为内皮细胞,绿色荧光(α-SMA)为平滑肌细胞,蓝色荧光(DAPI)为细胞核。在样品中段横截面(Cross section)、血管吻合处横截面(Anastomosis)和样品轴向横截面(Axial section)中均可观察到内皮细胞的红色荧光、平滑肌细胞的绿色荧光及细胞核的蓝色荧光,表明MBP-12.5管腔的内部形成了内皮层,并且在内皮层的下方有平滑肌细胞生成。Control中CD31的荧光比其他样本中的荧光更亮、更清晰,这意味着MBP-12.5的管腔内部虽然有内皮层的再生,但是内皮层的再生效果可能并没有自体血管好。此外,组织学染色结果(H&E以及Masson)也与免疫荧光的结果相对应。
图8 (A)MBP-12.5的植入示意图以及其植入后1-32周的多普勒彩超;(B)MBP-12.5植入32周的免疫荧光染色结果、H&E染色结果和Masson染色结果(每组黄色和红色虚框内的放大结果均在其下方显示)
全文下载链接:https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.124221
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