图1 基于喹啉螺旋的人工质子跨膜通道示意图

  日前，杭州师范大学材料与化学化工学院刘俊秋教授团队在Nano Letters上发表题为“Unimolecular Helix-Based Transmembrane Nanochannel with a Smallest Luminal Cavity of 1 ? Expressing High Proton Selectivity and Transport Activity”的通讯研究论文。

  众所周知，天然通道蛋白可以利用其独特的过滤结构实现对特定离子的高选择性跨膜传递。例如，天然钾离子通道KcsA是一种由四股螺旋组成的倒锥形结构，其内部最小尺寸为2.8 ?与钾离子尺寸高度匹配，能够有效的实现对钾离子的高选择性传递，并通过尺寸效应阻止其它离子的跨膜传输。受此启发，研究人员利用喹啉螺旋构建了一种内径约为1 ?的单分子人工质子跨膜通道，由于质子的尺寸非常小，可以轻易地通过该纳米孔道进行跨膜传递。而其它阴、阳离子以及水分子等由于具有较大的空间尺寸则被有效地排除在外（图1）。理论分析表明，该喹啉螺旋的十六聚体（16mer）的高度约为2.5 nm，能够以单分子形成嵌入磷脂膜的疏水层当中并介导质子的跨膜传递。而长度较短的四聚体（4mer）和八聚体（8mer）则没有表现出明显的质子跨膜传递性能。以往的人工质子通道通常是利用孔道内连续的水线结构实现质子的跨膜传递，在这个过程当中尽管可以排除其它离子的通过，但是却无法阻止水分子的传输。而该基于人工螺旋的质子通道内径仅有1 ?，可以同时将其它离子以及水分子排除在外，实现真正意义上的高选择性质子跨膜传递（图2）。

图2 喹啉螺旋的化学式与空间结构

  随后，研究人员又利用氢-氘交换核磁共振对该质子通道的传输机理进行了详细分析。首先采用溶解性更好的S-4mer作为研究对象，将其溶解到DMSO-d₆、CDCl₃和D₂O的混合溶剂当中，向溶液中加入少量的氘代盐酸（DCl·D₂O），然后监测螺旋内部活泼氢的变化。结果表明，螺旋空腔内部与亚甲基相连NH_b上的H与氘代盐酸中的D迅速发生交换，而NH_a上的氢原子的相对较为稳定，随后，从8mer和16mer的氢-氘交换实验中也得到了相同的实验结果。以上结果说明通道内连续NH_b结构在质子跨膜传递过程当中起到了关键的作用。溶液中水合的质子通过与NH上的活泼氢进行交换，并利用磷脂膜两侧质子浓度差为驱动快速实现选择性跨膜传递（图3）。

图3 喹啉螺旋进行质子传递的机理研究

  最后，利用单分子膜片钳实验对16mer的质子传递性能进行深入分析，并采用天然的短杆菌肽A作为对照样品（短杆菌肽A可以利用其内部连续水线进行质子跨膜传递）。研究表明在相同的条件下，16mer对质子的跨膜传输速率达到惊人的10⁷ H⁺?s^-1?channel^-1与短杆菌肽A的质子传输速率达到同一个数量级。然后通过在双层膜的trans和cis室内加入不同的电解质溶液（NaCl、KCl、HCl）并在磷脂膜两侧施加不同的电压测得其反转电位（V_rev），利用该值以及Goldman-Hodgkin-Katz 方程可以计算出16mer通道分子对H⁺和Na⁺，K⁺，Cl^-的渗透选择性比值分别为225.1, 74.8和99.6（图4）。该基于喹啉螺旋的跨膜通道为迄今已知内径最小的人工纳米孔道结构。此外，该工作还发现了一种基于连续NH基团实现质子跨膜传输的新机制。该研究结果对于理解和模拟天然离子通道的传输行为具有重要的生物学意义，也为今后开发人工离子通道在生物医药领域的潜在应用提供了全新的思路。

图4 人工质子跨膜通道的膜片钳单通道电流信号

  杭州师范大学材料与化学化工学院博士后研究人员闫腾飞为论文的第一作者，通讯作者为青年教师孙鸿程博士、于双江特聘教授和刘俊秋教授。该研究工作得到了国家科技部重点研发计划项目（2020YFA0908500, 2018YFA0901600）和国家自然科学基金（22001054, 22075065）的支持。

  论文连接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.nanolett.1c03858