天然细胞外基质（ECM）通过不断地提供生物物理和生物化学信号来指导细胞的行为和功能表达。水凝胶由于其优异的物理化学性质，作为一种可模拟天然ECM的新型生物材料已收到广泛关注，并在组织工程支架和再生医学领域显示出巨大的应用前景。其中，时空、剂量可精确操控的光化学反应可实现水凝胶生物物理、化学信号的引入，为模拟天然ECM中复杂的微环境从而实现细胞行为调控提供了强有力的工具。然而，目前大多数水凝胶体系中应用的光化学反应都需要额外加入光引发剂或光解反应过程中伴有机副产物的产生，这些都为构建细胞3D微环境带来潜在的生物毒性。因此，亟须寻找更加温和的光化学反应用于水凝胶3D细胞微环境的构建。

  针对上述问题，华东理工大学朱麟勇、包春燕教授团队报道了利用邻硝基苄醇（NB）光生醛基-亚胺偶联（PAIL）系列反应来调控3D水凝胶中生物活性分子的表达。该反应过程中除水分子之外不产生任何有机副产物，为光调控3D水凝胶中的生物化学信号提供了一种新的、温和的策略。进一步通过结合酶刺激降解调控生物物理信号，最终实现水凝胶中3D细胞行为的精准调控（Figure 1）。

Figure 1. NB photochemistry and enzymatic degradation regulate hydrogel 3D microenvironment to regulate cell behavior.

  研究人员首先通过小分子体系来验证NB的PAAL系列反应，如Figure 2a-c所示，经过紫外、HPLC、和LC-MS验证，NB光解后确实生成了醛基并可与氨基发生偶联反应。引入水凝胶体系后，NB的光化学反应可以实现水凝胶内BSA模型蛋白的空间、剂量可控固定（Figure 2d-g）。通过对接枝有RGD黏附肽的BSA（BSA-c(RGDfC)）进行精确图案化操控，如Figure 3，HDF细胞可在水凝胶表面呈现出明显的异质性分布，蛋白梯度光图案化能相应介导细胞的梯度黏附。

Figure 2. a-c) PAIL series reaction of NB, d) BSA immobilization by NB photochemical reaction in hydrogel, and e-g) Spatiotemporal protein immobilization.

Figure 3. Precisely controlled cell adhesion on hydrogels by gradient patterning of BSA-c(RGDfC).

  结合引入酶可降解的交联剂，通过3D细胞培养实验证明，包裹的HDF细胞在图案化的水凝胶中表现出不同的细胞行为。在BSA-c(RGDfC)光固定区域细胞呈现出纺锤状形态，然而在没有光照的区域，细胞仍然保持球形形态（如Figure 4a-b）。此外，与没有光照的区域相比，蛋白固定的区域显示出更高的细胞存活率和铺展面积。进一步将HDF细胞接种的胶原凝胶块包埋在水凝胶中并沿着凝胶块轴向光刻出一条蛋白通路后，随着时间的推移，HDF细胞逐渐向限定的路径迁移（如Figure 4c-d所示）。

Figure 4. Light-regulated cell spreading and migration in biodegradable hydrogel.

  本工作中，研究人员利用NB的PAIL系列反应实现3D水凝胶中黏附蛋白时空与剂量的可控分布，整个反应过程干净、高效，没有任何小分子的释放，通过光图案化技术在水凝胶中实现异质微环境构建，最终实现了包括细胞存活、铺展、迁移的行为调控。

  相关成果以“Precise Construction of Cell-Instructive 3D Microenvironments by Photopatterning a Biodegradable Hydrogel”为题发表在Chemistry of Materials上。文章第一作者为华东理工大学博士生蔡正伟，华东理工大学包春燕教授和朱麟勇教授为共同通讯作者。该工作得到了国家自然科学基金委的资助。

  论文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.chemmater.9b00706