复旦大学占昌友教授团队：羟基PEG可规避人群预存抗PEG抗体 - 助力LNP高效递送

2024-10-30 来源：高分子科技

聚乙二醇（PEG）作为一种经典的生物医用高分子辅料，广泛应用于大分子药物（如核酸和蛋白）或纳米药物的表面修饰（即PEG化），显著提高药物的水溶性并延长其血循环时间。然而，近年来在未使用过含PEG化药物或药物载体的健康人及临床患者体内检测到抗PEG抗体，即预存抗PEG抗体，且伴随含PEG日化用品的使用增多、检测抗PEG抗体技术手段进步等，预存抗PEG抗体的阳性检出率及水平逐年增加。预存抗PEG抗体会与纳米药物表面修饰的PEG结合，激活补体系统，引发一系列下游的生物学效应，包括加速药物的血液清除、增加非靶组织蓄积、形成膜攻击复合物导致包载药物提前泄漏、产生超敏反应等，严重影响纳米药物的疗效与安全性。如何系统设计并开发可有效规避临床预存抗PEG抗体的新型PEG辅料，是目前纳米药物递送领域亟待解决的重要科学问题。

鉴于此，复旦大学占昌友教授团队通过对多中心临床大样本血清进行预存抗PEG抗体筛查，并考察其与不同PEG材料的结合活性，发现羟基PEG（OH-PEG）能有效规避临床预存抗PEG抗体的结合。将市售脂质纳米粒（LNP）配方中的甲氧基PEG（MeO-PEG）替换为OH-PEG，可显著降低LNP在抗体阳性血清中的补体激活水平，减少过敏毒素的产生，并改善了LNP的血浆稳定性，降低巨噬细胞的脱靶摄取，有望实现LNP的高效递送，提升药物体内性能。相关成果发表于bioRxiv平台。

抗PEG抗体检测方法优化：0.05%Tween-20/PBS作为洗涤剂不影响抗体结合

研究人员首先对抗PEG抗体的ELISA检测方法进行了验证与优化，针对当前争议较大的一个问题——含有乙二醇重复单元的Tween-20是否可以作为洗涤剂用于抗PEG抗体的检测，进行了Tween-20和另一种被用于抗PEG抗体检测的洗涤剂CHAPS的对比研究。研究人员在血样孵育后加入不同浓度的Tween-20进行竞争结合，发现均不影响人血中预存抗PEG抗体与板中固定的PEG材料的结合，且在0.05%浓度以下不会影响动物体内抗PEG抗体和市售嵌合抗PEG抗体的结合。相反，使用CHAPS作为洗涤剂无法彻底去除板内非特异性结合的人IgG和HRP标记的二抗，从而严重干扰抗PEG抗体的正常检测。最终，研究人员选择0.05% Tween-20/PBS作为洗涤剂进行后续实验。

图1 Tween-20对抗PEG抗体检测的影响

人群预存抗PEG抗体检出率：18%人血样本呈现结合强阳性

研究人员选取目前市售PEG化制剂配方中的MeO-PEG作为抗原，利用ELISA检测了2074例健康人血清中的抗PEG IgM和IgG水平，并选取125例样本进行抗体滴度与1:4血清浓度时的吸光度值拟合，发现二者之间呈现良好的线性关系。这表明可以使用1:4血清浓度的吸光度值来代替滴度值，以进行大量样本的筛选，从而反映抗体水平的高低。将吸光度值大于1定义为强阳性（++），吸光度值在0.5-1之间定义为阳性（+），吸光度值小于0.5定义为阴性（-），发现人群中预存抗PEG IgM的阳性率要远高于抗PEG IgG。其中女性的抗体水平要高于男性，且呈现出随着年龄增加抗体水平逐渐降低的趋势。进一步对55例健康人不同时间点（大于3个月时间间隔）血清样本进行抗体检测，发现其抗体水平几乎没有变化，说明人体预存抗PEG抗体是持久存在的，可能对PEG化纳米药物产生长期影响。

图2 人群预存抗PEG抗体检出率

人群抗PEG抗体结合选择性：羟基PEG可规避抗体结合

研究人员选取了40例预存抗PEG抗体阳性样本，利用ELISA检测其与四种不同端基PEG材料（甲氧基、氨基、羧基和羟基）的结合活性。结果显示，预存抗体与PEG的结合呈现出明显的端基选择性，其中MeO-PEG结合最强，OH-PEG最弱。进一步选取人群样本中的所有抗体强阳性样本及部分阴性样本，对比甲氧基与羟基的结合活性，结果显示预存抗PEG IgM及IgG均主要识别MeO-PEG，而OH-PEG可有效规避预存抗体。研究人员还利用等温滴定量热法（ITC）检测抗PEG抗体与不同PEG材料结合时的放热情况，发现人血样本与OH-PEG滴定后释放的热量远低于MeO-PEG，进一步验证了OH-PEG规避临床预存抗PEG抗体的结合。

图3 人群预存抗PEG抗体的端基选择性

OH-PEG构建的LNP能有效改善预存抗PEG抗体结合引起的不良效应

基于上述发现，研究人员将市售脂质纳米粒（Spikevax（Moderna））配方中的MeO-PEG替换为OH-PEG，考察其对预存抗PEG抗体结合及对下游生物学效应（如补体激活、血清稳定性、靶细胞与非靶细胞摄取）的影响。结果显示，OH-LNP吸附预存抗PEG抗体显著减少，导致补体激活水平减弱，有望缓解因补体激活引起的临床输液反应和超敏反应等副作用。由于补体激活产物——膜攻击复合物C5b-9的减少，OH-LNP在血清中的稳定性提高，同时在不影响靶细胞（肝细胞）摄取的前提下显著减少了巨噬细胞的摄取，有望避免LNP在体内被快速清除，提升药物体内性能。

图4 人群预存抗PEG抗体结合与下游生物学效应的差异

抗PEG抗体的结合位点存在物种差异

由于目前缺乏对人群中预存抗PEG抗体起源与产生机制的充分认知，大多数临床前试验均采用PEG化纳米载体（多为脂质体）来刺激产生抗PEG抗体。研究人员对小鼠、大鼠和比格犬体内经过刺激产生的抗PEG抗体进行考察，发现与人预存抗PEG抗体不同，动物体内经PEG化脂质纳米载体刺激所产生的抗体主要结合乙二醇重复单元，对PEG末端基团无选择性。进一步考察补体激活的物种差异，发现OH-LNP在小鼠和大鼠血清中增加了补体激活水平的迹象，在比格犬血清中与MeO-LNP的补体激活水平相当，而在人血清中补体激活水平显著减少。这一现象与补体系统的物种差异有关。抗PEG抗体结合模式和补体激活途径的物种差异可能会误导研究者将注意力转向被认为是惰性的MeO-PEG，从而阻碍OH-PEG的基础研究、临床开发与应用。

图5抗PEG抗体的物种差异

羟基LNP免疫原性较低

考虑到LNP在使用时往往需要重复给药，因此在动物体内考察了重复注射LNP后抗PEG抗体的产生。研究发现，在比格犬中，重复注射MeO-LNP诱导了明显的抗PEG IgM和IgG抗体，而OH-LNP产生的抗体水平较低，即免疫原性更低。在小鼠中，两种LNP均未产生明显的抗PEG抗体，这可能是由于PEG-DMG快速从LNP上脱落，以及小鼠对PEG材料相较于比格犬更不敏感所致。综上所述，OH-LNP的免疫原性显著低于MeO-LNP，有利于满足临床重复给药的需求。

图6重复注射LNP后在比格犬体内产生的抗PEG抗体水平

本研究首次发现人群预存抗PEG抗体对PEG的结合具有端基选择性，羟基PEG有能力规避预存抗PEG抗体的识别，从而显著降低脂质纳米粒的补体激活水平，改善下游生物学效应，对降低临床脂质纳米粒的副作用、提升临床应用效果具有重要意义。

原文信息：

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.10.21.619346v1

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（责任编辑：xu）

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