东华大学史向阳教授团队 Nano Today：基于含磷树状大分子的药物递送系统协同增强自噬、抗炎和抗氧化治疗阿尔茨海默症

2025-02-11 来源：高分子科技

阿尔茨海默病（AD）是最常见的神经退行性疾病之一，其特点是神经元逐渐退化，导致认知能力逐渐下降。随着病情的发展，患者可能完全丧失生活自理能力，难以适应周围环境。AD的发病机制错综复杂，包括β-淀粉样蛋白（Aβ）的异常聚集、激活的小胶质细胞引发氧化应激和神经炎症、神经元功能障碍等，加上血脑屏障（BBB）带来的巨大挑战，极大地阻碍了治疗药物向病灶区域的有效输送。目前的单药疗法只能针对AD发展过程中的特定方面，而在解决整个病理途径的疗效有限。寻求全面调节脑部炎症微环境以有效改善AD病理的治疗策略至关重要。

自噬被广泛认为是一种自我保护机制，它能使细胞承受各种环境压力，如营养或生长因子匮乏、缺氧、活性氧（ROS）或DNA损伤。加强细胞自噬以加速Aβ聚集体的分解和代谢被认为是一种很有前景的治疗策略，尤其是在神经退行性疾病中。雷帕霉素（Rap）可通过调节小胶质细胞活性和减少促炎介质的分泌，因而具有抗神经炎和神经保护特性。此外，Rap通过抑制mTOR活性促进自噬体形成，促使自噬体与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，可有效清除神经元细胞中受损或异常积累的蛋白质，如Aβ和α-突触核蛋白。

纳米平台的开发为有效治疗AD提供了新途径。其中，羟基封端的含磷树状大分子不仅可以作为纳米载体有效穿透BBB，实现大脑的靶向给药，而且还表现出独特的生物特性，如抗炎和免疫调节活性。这些树状大分子在发挥内在生物活性的同时，还能抑制异常蛋白质聚集，因而在治疗神经退行性疾病方面具有双重潜力。与此同时，纤连蛋白（FN）通过抑制核因子卡巴-B（NF-κB）信号通路、减少促炎因子的表达以及促进巨噬细胞向M2表型转化，表现出显著的抗炎和抗氧化特性。FN在治疗神经退行性疾病方面大有可为，特别是由于其Arg-Gly-Asp(RGD)序列可促进其靶向小胶质细胞表面整合素，增强其调节神经炎症和氧化应激的能力。在近期的工作中，团队构建了亚磷酸钠或羟基封端的含磷树状大分子/FN纳米药物，通过结合树状大分子自身的抗炎活性以及FN的抗炎抗氧化活性协同缓解巨噬细胞或小胶质细胞内氧化应激，促进M2分型，降低炎症反应，成功用于急性肺损伤/痛风、缺血性脑卒中和帕金森病的抗炎/抗氧化治疗（ACS Nano 2024, 18, 2195-2209; Adv. Healthcare Mater. 2024, 13, 2401462; Bioact. Mater. 2024, 38, 45-54）。

基于此，东华大学史向阳教授团队与法国国家科学研究中心Jean-Pierre Majoral院士团队合作构建了自身具有生物活性的羟基化的含磷树枝状大分子负载FN和Rap的纳米复合物（R@A/F NCs），旨在利用综合抗炎、抗氧化和自噬增强特性来高效治疗AD（图1）。第一代羟基端含磷树状大分子（AK76）通过静电作用、氢键作用、阳离子-π作用和疏水作用与FN复合，并通过疏水作用进一步负载Rap。形成的R@A/F NCs具有良好的稳定性、细胞相容性和靶向性能。R@A/F NCs能在体外通过降低ROS水平、恢复线粒体膜电位（MMP）、增强自噬、促进小胶质细胞M2极化和抑制炎性细胞因子分泌等方式协同调节小胶质细胞。在树状大分子末端羟基的帮助下，R@A/F NCs可以穿过BBB，并通过减轻脑部炎症、刺激自噬和促进Aβ蛋白降解来修复AD小鼠模型的认知和记忆损伤。

图1. R@A/F NCs的合成及其用于AD的联合治疗示意图。

研究团队发现当AK76/FN的质量比为2时，形成的纳米复合物（NCs）具有最佳的水动力学直径和较小的多分散指数（PDI，图2A），所形成的NCs都显示负的表面电位，这是由于FN的负电荷在与AK76复配后保持不变（图2B）。制备的A/F NCs与R@A/F NCs呈现球形，在负载Rap后，尺寸由144.4 nm增加到187.3 nm（图2C-D）。细胞毒性实验结果表明R@A/F NCs对BV2细胞和SH-SY5Y细胞具有良好的细胞相容性（图2E）。用R@A/F-Cy5.5 NCs处理的BV2细胞内的荧光强度远高于用游离FN-Cy5.5处理组（图2F-G）。细胞吞噬机制探究结果表明，大多数R@A/F NCs能通过网格蛋白依赖和巨胞饮介导的途径被BV2细胞有效吸收，同时依赖于RGD介导的内吞途径。

图2. （A）不同AK76/FN质量比（1、2、4、6、8或10）下AK76、游离FN或A/F NCs的水动力学直径和PDI以及（B）zeta电位。（C）AK76/FN质量比为2时R@A/F NCs的TEM图像和（D）尺寸分布直方图。（E）SH-SY5Y和BV2细胞经不同浓度AK76的R@A/F处理后的活力。（F）用PBS、游离FN-Cy5.5或A/F-Cy5.5 NCs处理BV2细胞后的相对荧光强度。（G）CLSM观察用FN-Cy5.5或R@A/F-Cy5.5 NCs培养8小时后BV2细胞内的荧光。（H）用多种抑制剂预处理后再用R@A/F-Cy5.5 NCs培养2小时的BV2细胞的流式细胞术直方图。

研究团队通过WB测试发现R@A/F NCs的处理能够明显降低Aβ挑战的BV2细胞中P62蛋白（主要负责标记细胞内受损的蛋白质以通过自噬体降解）表达量，上调ATG5蛋白（自噬体形成和成熟的关键蛋白）的表达，表明有效促进线粒体自噬（图3A-B）。通过CLSM观察到R@A/F NCs的处理使得激活的BV2细胞的MMP恢复正常，促进线粒体平衡（图3C）。同时，R@A/F NCs通过降低细胞内ROS的产生以缓解氧化应激（图3D-E）。联合AK76的抗炎活性和FN的抗炎/抗氧化活性，R@A/F NCs促进小胶质细胞M2极化，显著降低促炎细胞因子包括TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌（图3F-I）。通过量化免疫染色结果，我们发现R@A/F NCs处理导致Aβ挑战的BV2细胞中p-p65表达显著下调，表明R@A/F NCs能够有效抑制NF-κB通路的激活，增强其抗炎功效（图3J）。

图3.（A）WB检测分析不同处理后Aβ处理的BV2细胞中P62和ATG5的蛋白表达水平。（B）P62蛋白相对表达量的定量分析。（C）CLSM检测不同材料处理的Aβ挑战的BV2细胞中MMP变化。（D）CLSM观察不同处理后Aβ挑战的BV2细胞中ROS的表达。（E）不同处理后Aβ挑战的BV2细胞中ROS表达的平均荧光强度。（F）通过流式细胞术评估不同处理后Aβ挑战的BV2细胞中CD86和CD206的表达水平。ELISA分析BV2细胞中（G）TNF-α、（H）IL-1β和（I）IL-6的分泌水平。（J）通过CLSM观察分析不同处理后Aβ挑战的BV2细胞中p-p65的相对表达水平。

研究团队发现与FN-Cy5.5组相比，R@A/F-Cy5.5 NCs组在AD小鼠脑部的荧光信号明显增加，并在注射后6小时达到峰值。这表明，R@A/F NCs成功穿透BBB并在大脑中蓄积，这可能是由于AK76含磷树状大分子表面的羟基引起的。在静脉注射后6小时，肝脏和肾脏区域的荧光强度升高表明R@A/F-Cy5.5 NCs和FN-Cy5.5可通过网状内皮系统被有效清除，凸显了R@A/F NCs卓越的脑靶向和清除特性（图4）。

图4. （A）小鼠活体成像照片和（B）尾静脉注射R@A/F-Cy5.5和FN-Cy5.5后0、0.5、1、2、4和6 h脑区的荧光值。（C）注射R@A/F-Cy5.5或FN-Cy5.5后6小时小鼠离体器官荧光成像照片和（D）主要器官（包括肺、心、肝、肾、脾和脑）的荧光值。

由于NCs具有显著的氧化应激缓解作用、抗炎特性、BBB通透性和精确靶向能力，研究团队进一步通过新物体识别（NOR）测试、Y迷宫测试和莫里斯水迷宫（MWM）测试以评价R@A/F NCs的体内疗效（图5A）。在NOR测试中，R@A/F NCs处理后，识别指数最高，能够明显恢复AD小鼠对新奇事物的探索兴趣，改善小鼠的认知功能（图5B-C）。Y迷宫测试结果显示R@A/F NCs治疗的AD小鼠在新臂上探索的时间显著增加，表明R@A/F NCs能够缓解记忆缺陷。MWM测试结果表明，R@A/F NCs组的AD小鼠在目标象限内的游泳时间显著增加，逃逸潜伏期在除正常组以外的所有治疗组中最短，穿越平台的次数增加，反映出R@A/F NCs治疗后小鼠的记忆和学习能力明显提高（图5D-G）。

图5. （A）AD小鼠的治疗和测试安排。（B）不同组别AD小鼠在NOR测试中的代表路径。（C）根据（B）计算的识别指数量化。（D）不同组别小鼠在MWM测试中的游泳轨迹。红点表示起点，黑点表示终点。（E）不同组小鼠在目标象限内的时间、（F）逃逸潜伏期和（G）穿越平台的次数。

研究团队进一步研究了R@A/F NCs治疗的潜在机制。体内结果显示，R@A/F NCs可有效降低脑内Aβ的积聚以及电离钙结合适配分子-1（IBA-1）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）等活化标志物的表达，表明大脑中的炎症状态得到有效缓解。R@A/F NCs处理后，脑内ROS水平下降最为明显，表明纳米药物中的各种成分具有协同作用，可通过Rap诱导自噬，并通过Rap和FN消除ROS。WB结果表明，R@A/F组处理后脑内mTOR表达水平最低，同时ATG5蛋白增加最多，自噬底物P62减少最明显。CD206和CD86的免疫荧光分析进一步显示，R@A/F NCs处理导致小鼠脑内CD86水平显著降低，CD206表达明显升高，表明脑内小胶质细胞的有效M2再极化。此外，经R@A/F NCs治疗的小鼠脑部海马细胞出现了良好的组织结构，神经元数量明显恢复，与健康小鼠相当（图6）。

图6.（A）不同组小鼠脑部Aβ、IBA-1/GFAP和ROS的免疫荧光图像。（B）Aβ、（C）GFAP和（D）IBA-1在不同组中的相对表达量。（E）mTOR、ATG5和P62的WB表达分析。（F）不同处理后小鼠脑部CD86/CD206的免疫荧光染色。（G）不同组海马区的H&E染色和神经元的Nissl染色。

简而言之，该研究设计的纳米药物具有以下优势：（1）以含磷树状大分子为基础的递送系统显著提高了FN和Rap的生物利用度，同时末端羟基赋予NCs穿透受损BBB的能力，通过FN介导靶向过表达α₄β₁整合素的小胶质细胞，促进纳米药物靶向递送至AD病变部位；（2）R@A/F NCs可协同AK76、FN和Rap的抗炎和抗氧化作用，促进氧化应激缓解、线粒体功能恢复、自噬增强和诱导小胶质细胞M2极化，从而协同抑制Aβ的聚集并改善AD认知缺陷。所开发的纳米药物结合了生物活性含磷树状大分子和多组分药物治疗AD的优势，有望用于不同神经退行性疾病的免疫调节治疗。

以上研究成果以“Codelivery of Fibronectin and Rapamycin via Bioactive Phosphorus Dendrimers to Ameliorate Alzheimer’s Disease through Macrophage Autophagy, Oxidative Stress Alleviation and Polarization Modulation”为题，在线发表于国际著名期刊Nano Today（DOI: 10.1016/j.nantod.2025.102664）。东华大学生物与医学工程学院史向阳教授为通讯作者，东华大学博士生詹梦偲和硕士生戴外从为共同第一作者。该工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、上海市科委等项目及中央高校基本科研业务费专项资金的资助。

文章链接：https://doi.org/10.1016/j.nantod.2025.102664

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（责任编辑：xu）

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