福州大学杨建民、石贤爱课题组 Acta Biomater.：具有细菌原位检测与清除功能的智能伤口敷料

2023-12-18 来源：高分子科技

感染会阻碍伤口愈合过程，甚至可能导致危及生命的并发症，如组织坏死、器官衰竭和败血症。因此，早期及时发现和治疗感染性病原体对于防止伤口进一步恶化至关重要，并有利于伤口护理。目前，临床检测病原体的金标准主要包括平板培养、聚合酶链反应(PCR)、测序等。虽然这些方法相对灵敏可靠，但复杂的工作流程，包括繁琐的样品预处理和数小时至数天的检测时间，可能会错过治疗机会。此外，这些检测方法的应用受到对精密仪器和熟练操作人员需求的限制，使其难以在医疗资源有限的地区或在现场实施。因此，迫切需要开发简单、快速、经济、可现场操作的伤口感染性病原体检测分析策略。当前，无需实验室设施的即时检测(POCT)方法已经成为一种可行的替代方法，也是病原体检测研究的焦点。虽然POCT方法在检测伤口细菌方面卓有成效，但它们通常没有考虑到伤口护理的其他重要方面，如伤口保护、抗菌特性和促进愈合。此外，以往主要基于伤口温度、pH变化判定伤口感染程度的方式，其准确性往往受环境和生理干扰因素较大。

近日，福州大学生物科学与工程学院杨建民、石贤爱课题组，将即时检测(POCT)策略和光动力抗菌(PDT)技术相结合构建了一种新型智能敷料，用于原位检测和清除伤口致病菌。该研究以羧甲基壳聚糖和氧化海藻酸钠为基质，加入4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷(MUG)和二氧化钛包覆的上转化纳米颗粒(UCNPs@TiO₂)制备智能水凝胶敷料。该敷料能够与细菌分泌的β-葡萄糖醛酸酶(β-GUS)反应生成4-MU，后者在紫外光激发下发出裸眼可见的蓝色荧光，从而实现对细菌进行可视化检测。合成的UCNPs@TiO₂光敏剂，能够在近红外光照射下生成活性氧(ROS)，从而具有较高的PDT抗菌性能。同时，能够根据细菌检测的诊断结果，调整近红外光照射的时间和频率。此外，构建了一套基于智能手机的便携式检测系统，并配备了自主开发的Android APP，可在几秒钟内对病原体进行原位检测。该研究采用大肠杆菌—金黄色葡萄球菌混合菌液构建SD大鼠全层皮肤创面感染模型，系统评价了智能伤口敷料的体内抗菌活性和促愈合能力。

图1. 智能伤口敷料示意图。(a) 智能伤口敷料结构。(b) 同时原位检测和清除伤口部位的致病菌。(c) 紫外光下细菌原位可视化检测机制。(d) 近红外光下抗菌机理。

已知MUG分子含有糖苷键，可被β-GUS酶解成4-MU和β-D-葡萄糖醛酸，而4-MU在紫外光照射下可产生蓝色荧光。由于常见的伤口病原菌，如大多数肠杆菌科、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和铜绿假单胞菌都能分泌β-GUS，因此将MUG掺入透明度较高的水凝胶敷料中可以实现伤口细菌的原位可视化检测。该研究分别通过肉眼和智能手机检测装置观察水凝胶敷料—大肠杆菌共孵育后蓝色荧光强度变化。结果表明，在相同的培养时间下，荧光强度随细菌浓度的增加而增加，表明可以实现细菌的可视化检测与感染程度判定。但与基于智能手机的检测装置相比，裸眼识别的灵敏度较低。只有当细菌浓度高于10⁶ CFU/mL时，可以裸眼观察到显著荧光强度差异；而在智能手机检测装置中，细菌浓度为10³ CFU/mL即可观测到显著荧光变化。同时，ImageJ处理结果显示出了类似的变化趋势。在此，裸眼的低灵敏度主要是由于紫外线光源的位置和角度变化、水凝胶的表面光反射、环境光的干扰等导致激发光强度不一致，这也是裸眼检测的共性问题。据报道，当伤口细菌数量达到10⁵左右时，通常可被认定为感染。因此，虽然可以通过裸眼观察识别已感染的伤口，但为了实现感染的早期发现，还是需要借助智能手机检测装置。

图2. (a) 裸眼观察和(b) 基于智能手机的检测设备进行大肠杆菌检测示意图以及记录的荧光照片。

为了方便检测，自主开发了Android APP命名为“Pathogenic Detection”用于快速准确地检测和诊断伤口细菌感染情况。该APP主要用于通过测量不同浓度细菌—智能伤口敷料共孵育的荧光强度（转换为RGB值）来分类感染水平。如前所述，10⁵ CFU/mL的细菌量被认为是伤口感染的临界阈值。同时，为了及时发现伤口细菌，将智能伤口敷料—细菌共培养1小时后的荧光强度作为判断伤口感染的标准。通过分析大量结果后设定：当RGB值中的B值低于124时，将感染级别定义为“Low-risk”；当B值处于124—184时，将感染级别定义为“Infected”；当B值高于184时，将感染级别定义为“Severe”。在此，不同的诊断水平可作为选择相应抗菌治疗策略的参考。例如，“Low-risk”结果表示无需进行抗菌治疗，而“Infected”结果则需要立即进行PDT抗菌治疗。一旦检测到“Severe”级，有必要增加抗菌治疗的频率。此外，该APP与基于智能手机的检测设备相结合，可以在几秒钟内检测和诊断伤口感染情况。

图3. “Pathogenic Detection”APP手机界面及检测流程，所用智能手机为小米Redmi K30 Ultra。

将智能伤口敷料浸入大肠杆菌—金黄色葡萄球菌混合悬液中评价其体外细菌检测和抑制能力。在细菌刚接触敷料时，由于没有生成4-MU，所有组的B值都处于“Low-risk”水平。此外，未添加细菌的敷料随着时间的推移，B值始终低于100。然而，添加细菌的敷料在培养3 h后B值增加到150左右，即“Infected”。此外，实验组在培养6 h后B值升高至170左右，仍处于“Infected”水平，而敷料+细菌组的B值约为240，处于“Severe”水平。这种差异主要是由于敷料+细菌组未经近红外照射（无抗菌效应），因此敷料的荧光强度随着细菌的增殖而不断增加。相反，实验组在NIR照射下，大部分细菌在3 h时被光敏抗菌剂产生的ROS消灭，残留的β-GUS和细菌导致荧光信号增长缓慢。

图4. 智能伤口敷料体外原位致病菌检测与抑制测试。(a) 体外细菌检测及抑制示意图及(b)试验结果。(c) 采用基于智能手机的检测系统检测实验组的检测诊断结果。

该研究采用全层皮肤缺损SD大鼠，评价了智能伤口敷料的体内细菌检测及抑制作用。与正常伤口相比，在紫外线照射下，感染伤口可见蓝色荧光。感染创面第0天通过智能手机检测系统测得B值约为221，明显高于正常组(约120)，表明创面处于“Severe”感染阶段。感染创面B值随着近红外光处理逐渐降低，直至与正常组一致，说明创面细菌数量减少，并得到有效抑制。提取不同时间点创面渗出液进行细菌培养。近红外光处理后的细菌数量明显减少。第6天几乎没有观察到明显的菌落。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的存活率均降至5%以下。值得一提的是，该研究中的抗菌治疗仅在敷料更换时进行。因此可以推断，增加抗菌治疗次数将加速细菌清除效果。以上结果表明，该智能伤口敷料具有良好的细菌检测和响应性抗菌能力，可作为一种新型伤口敷料用于伤口感染的原位检测和按需抗菌治疗。

图5. 智能伤口敷料体内原位致病菌检测与抑制。(a) 体内细菌检测与消灭示意图。(b) 用裸眼观察感染和正常SD大鼠伤口敷料的荧光。(c) 基于智能手机的检测系统检测结果。(d) 感染伤口菌落计数。

兼具原位检测和清除细菌的智能伤口敷料可以准确评估创面细菌感染情况，根据需要进行精准抗菌治疗，从而提高创面护理效率，促进创面个性化治疗。然而，目前这类敷料报道较少。虽然可以通过在敷料中嵌入复杂的生物传感器或电子元件来实现原位细菌检测，但是较高的生产成本和复杂的伤口护理方式具有应用局限。同时，以往主要基于伤口温度、pH变化判定伤口感染程度的方式，其准确性往往受环境和人体生理干扰因素较大。此外，尽管使用颜色变化作为伤口感染检测是一种方便实用的方法，但是仅仅依靠裸眼识别和判断的视觉检测方法往往受到个体感官差异的影响。由于当前智能手机的广泛使用和固有优势，包括高效率、非侵入性、便携性以及安装第三方APP作为信号读取器的能力，因此基于智能手机的POCT方法受到了较高关注。此外，伤口愈合的实时过程数据可以根据需要传送给远程医疗人员，从而实现远程护理。

该研究研制了一种能同时原位检测和清除致病菌的智能伤口敷料。其中，细菌的存在可以通过跟踪敷料的蓝色荧光直观地检测出来。同时，利用构建的基于智能手机的检测系统，在达到感染极限前对病原菌进行检测和诊断。此外，该智能敷料通过近红外照射下的光动力抗菌效应，能够有效地按需杀灭创面关键致病菌。该研究提出的智能伤口敷料能够在早期及时发现和治疗感染性病原体，有利于伤口管理。该项成果以“Intelligent Wound Dressing for Simultaneous in situ Detection and Elimination of Pathogenic Bacteria”为题发表在Acta Biomaterialia期刊上。福州大学杨建民副教授为本论文第一作者，通讯作者为石贤爱教授和日本东京都立大学的毛思锋助理教授，其中所用的Android APP为福州大学高跃明教授团队设计开发。该研究工作得到了福建省自然科学基金、福建省海洋经济发展专项等项目的资助。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.actbio.2023.11.045

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（责任编辑：xu）

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