在纳米医学领域，纳米材料已被开发和证实可以用于肿瘤免疫治疗，包括改变肿瘤微环境将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，以及合理重塑免疫微环境以产生强大的免疫应答，例如，通过使用化疗、光热治疗、光动力治疗等策略诱导癌细胞产生免疫原性细胞死亡（ICD）。ICD可以增强树突细胞的抗原递呈、T细胞的激活，从而增加对实体瘤的免疫刺激和破坏免疫抑制效应。常规疗法与ICD的结合，为抗肿瘤治疗提供了新的途径和研究方向。然而，ICD触发的肿瘤微环境（TME）重塑只能提供次优的癌症免疫治疗结果，容易造成第二次的肿瘤免疫逃逸。最重要的是，尽管患者体内存在大量新抗原，但由于未能获得充分和持久的抗肿瘤免疫应答，基本上难以实现肿瘤的完全治愈。这主要是由于树突细胞（DCs）存在免疫逃逸效应，限制其有效抗原呈递能力，导致ICD效应无法从根本上影响淋巴结中的DCs和T细胞的活化。那么如何促进抗原递呈细胞（APC）的抗原递呈能力，触发原位肿瘤抗原释放，以增强免疫原性和抗肿瘤免疫响应，是开发有效纳米药物用于免疫治疗的关键。

  有研究表明，DCs中的YTHDF1蛋白是实现增强肿瘤免疫治疗的潜在治疗靶点之一，YTHDF1蛋白（RNA m6A甲基化的重要读取器蛋白）涉及DCs相关的抗肿瘤免疫过程，其下调可有效增强DCs的肿瘤抗原交叉呈递能力，限制DCs的免疫逃逸效应，进一步提高细胞毒性T细胞在肿瘤部位的浸润并改善抗肿瘤免疫。因此，通过设计巧妙的纳米平台，一方面利用纳米平台实现化疗及化疗相关的ICD效应，增强免疫效应，另一方面增强DCs抗原递呈能力，打破免疫逃逸瓶颈，可实现协同的癌症免疫治疗，这无疑为扩大和加强免疫治疗提供了新思路。

  在研究团队前期工作中，已经证明金刚烷（Ad）修饰的第三代（G3）聚酰胺-胺（PAMAM）树状大分子和β-环糊精（β-CD）修饰的第五代（G5）PAMAM树状大分子之间可以通过主客体识别，自组装形成G5-CD/Ad-G3核壳结构树状大分子（CSTDs）。合成的CSTDs显示出比单独G5更高的基因转染效率、药物上载率以及增强的钆配合物r₁弛豫率和基于增强渗透滞留（EPR）效应的被动靶向，现已成功应用于乳腺癌细胞的基因、化疗的联合治疗和弛豫率及EPR效应双重增强的肿瘤磁共振成像（J. Mater. Chem. B 2020, 8, 2768-2774，Biomacromolecules 2021, 22, 2181-2188）。此外，壳层分子G3-Ad还可作为独立模块分别修饰吡啶、皮啡肽和RGD肽，经过主客体识别G5-CD自组装形成多功能CSTDs，乙酰化并络合铜离子合成多功能CSTD-铜络合物后，通过皮啡肽与μ-阿片受体结合跨越BBB，利用RGD靶向脑胶质瘤，运用铜离子的r₁弛豫性能和发生类芬顿反应的能力，实施原位脑胶质瘤的磁共振成像和化学动力学治疗（Nano Today 2021, 41, 101325）。然而，目前还没有报道涉及使用CSTD负载药物进行化疗-免疫治疗，也没有递送功能性基因对DCs进行改造，从而改善肿瘤的免疫治疗。

图1. 基于CSTDs的双纳米模块的制备和作用示意图。

图2. CSTDs和基于CSTDs的纳米模块的表征。G5.NHAc/G3.NHAc（A，B）和CBAA-G5/G3-Man（C，D）的AFM图；（E）CBAA-G5/G3-Man的抗蛋白吸附试验图；（F）基于DOX的各材料紫外吸收曲线；（G, H）G5-G3-D复合物的AFM图；（I）不同pH条件下，G5-G3-D复合物中DOX体外释放动力学研究图；（J）不同N/P比下，CBAA-G5/G3-Man压缩YTHDF1 siRNA的琼脂糖凝胶阻滞实验图；CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA复合物在不同N/P比条件下的流体动力学尺寸（K）和ζ电位（L）。

图3. G5-G3-D复合物纳米模块的体外化疗效果和ICD效应。（A）不同材料处理后的4T1细胞活力图；（B）不同浓度的G5-G3-D复合物处理后4T1细胞的凋亡情况统计图；各组材料与4T1细胞共孵育后，（C）CRT的表达，（D）HMGB-1的释放，各组材料刺激DCs熟化的流式统计图（E）和流式分析图（F）。

图4. CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA复合物纳米模块的基因转染效果和DC成熟评估。（A）不同材料处理DCs 4小时后的共聚焦显微镜图像；（B, C）不同条件（有无Man阻断）下，CBAA-G5/G3-Man/Cy3-YTHDF1siRNA复合物处理4小时后，DCs的吞噬效率；（D）基于WB测定的蛋白质表达图像和定量分析图：1-4分别代表PBS、CBAA-G5/G3-Man、游离YTHDF1 siRNA和CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA复合物；分别用PBS（I）、游离YTHDF1 siRNA（II）、CBAA-G5/G3-Man/ NC siRNA（III）和CBAA-G5/K3-Man/YTHDF1 siRNA（IV）处理DCs 24小时后，刺激DCs熟化的流式统计图（E）和流式分析图（F）

图5. 体内抗肿瘤效果。（A）两种基于CSTDs的纳米模块：G5-G3-D复合物与CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA复合物组合的处理方案图。治疗期间小鼠体重变化图（B）、相对肿瘤体积变化统计图（C）和代表性肿瘤图片（D）。（E）治疗15天后小鼠肿瘤部位的TUNEL和H&E染色图。对于（B-F）：Ⅰ代表PBS；Ⅱ代表游离DOX；Ⅲ代表G5-G3-D；Ⅳ代表CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA；V代表游离DOX + CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA；VI代表G5-G3-D + CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA。

图6.体内免疫反应。不同组治疗后15天肿瘤切片中CRT的免疫荧光染色（A）和血清中细胞因子TNF-α（B）、IFN-γ（C）和IL-6（D）水平以及脾脏中CD4⁺和CD8⁺T细胞的流式细胞术测定数据（E-G）。对于（A-G）：Ⅰ代表PBS；Ⅱ代表游离DOX；Ⅲ代表G5-G3-D；Ⅳ代表CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA；V代表游离DOX + CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA；VI代表G5-G3-D + CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA。

  简而言之，该研究基于CSTDs设计的双纳米模块充分利用了CSTDs相对于单代树枝状大分子在改善药物负载、放大肿瘤穿透/EPR效应和提高基因递送效率方面的优势，具有以下特点：1）G5-G3-D复合物作为其中一个纳米模块用于肿瘤的化疗，同时用于ICD诱导使DCs成熟；2）CBAA-G5/G3-Man/YTHDF1 siRNA复合作为另一个纳米模件，通过对DCs中YTHDF1表达的基因沉默来刺激DCs成熟，增强其抗原递呈能力；3）这两大纳米模块通过对癌细胞和DCs的程序化治疗以协同增强T细胞介导的肿瘤免疫治疗，从而实现了对小鼠原位乳腺癌模型的增强型化学免疫治疗。本研究制备的CSTDs双纳米模块为协同调节T细胞以实现增强的抗肿瘤化学免疫治疗提供了新思路。

  文章链接：https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2023.05.021