探究聚合物多级结构与其性质及功能之间的关系是高分子科学领域一个永恒的主题。相关研究对于高分子材料的理性设计以及生物功能的调控具有重要意义。然而，由于真实生物及材料体系的复杂性，传统体相平均实验方法难于定量建立这种联系。通过将真实体系进行模块化分割，提取出其中的关键要素，从微纳尺度乃至单分子水平进行研究，是建立上述联系的有效途径。单分子力谱技术可以对单个聚合物链进行操纵，提供皮牛顿级别的力学测量精度以及亚纳米尺度的空间分辨率，成为研究聚合物纳米力学性质（包括分子内、分子间相互作用等）以及链结构与其动态行为的有效方法。
吉林大学张文科教授课题组结合其在相关领域的工作积累，近期在《Macromolecules》上发表了题为“Manipulation of a Single Polymer Chain: From the Nanomechanical Properties to Dynamic Structure Evolution”的前景展望（Perspective）文章。该文章首先简要介绍了聚合物分子偶联及探针选择对单分子操纵实验的重要性。接着总结了近年来基于原子力显微镜技术（AFM）的单分子力谱方法在研究聚合物结构与纳米尺度力学性质方面的进展，包括聚合物单晶纳米力学性质、聚合物共价力化学以及聚合物纳米复合材料体系。随后总结了基于AFM的单分子力谱及单分子磁镊技术在研究具有重复序列的长链DNA高级结构及其动态演化机制（图1）。最后，讨论了聚合物单分子操纵领域的未来挑战和机遇。作者希望该文能引起材料、生物和理论模拟与计算等研究领域的相关人员的进一步关注与参与，深化对聚合物结构-性能（功能）关系的理解。
图1. 单分子力谱技术（SMFS）在材料和生物体系中的应用。
（一）聚合物纳米力学性质
研究半结晶聚合物链组成与链间相互作用及链折叠/解折叠等动态结构演化之间的联系，对于高分子材料的设计、加工和使役具有重要的意义。半结晶性高分子材料通常由结晶相及无定形相等多级结构组成，其在受力形变过程中往往伴随着无定形相拉伸、片晶熔融、无定形链滑移、拉伸诱导结晶以及共价键断裂等多层次的结构演化过程（图2）。上述过程往往还会发生叠加，难以提取出某一结构（例如片晶）对材料力学性质的贡献，导致宏观拉伸实验难以建立结构与力学性质间的联系。
图2. 半结晶性高分子材料在拉伸过程中的多层次结构演化示意图。（1）无定形相拉伸；（2）片晶中聚合物链解折叠与结晶相熔融；（3）无定形链滑移穿越片晶结构；（4）拉伸诱导结晶；（5）共价键断裂。
1．聚合物单晶的纳米力学性质
聚合物单晶是研究半结晶聚合物材料力致熔融行为和链折叠的理想体系。张文科教授课题组于2011年首次报道了聚氧乙烯（PEO）单晶体系纳米力学性质的研究结果。通过将原子力显微镜（AFM）成像与单分子力谱技术有机结合，并辅以合适的样品制备及偶联方法，成功地将单条高分子链从PEO晶体中提拉出来，定量测量了晶体中高分子链间作用力的大小（J. Am. Chem. Soc., 2011,133, 322）。在此基础上，该课题组进一步克服样品制备等难题，将其发展成一种普适性的研究方法，成功地将该方法应用到聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）、尼龙66（PA66）、尼龙6（PA6）、聚乳酸（PLLA）和聚己内酯（PCL）等众多高分子晶体体系当中。结合聚合物单分子力谱和受控分子动力学模拟，系统考察了晶体中聚合物链构象（螺旋，平面锯齿，非平面锯齿）链组成、折叠模式以及外界环境等对纳米力学性质的影响规律。建立了晶体中高分子链构象与链运动模式之间的联系：螺旋链在受力拉伸时采取螺旋运动模式，力值变化较平稳、波动较小，而锯齿链会发生粘滑运动（stick-slip）导致力值出现锯齿状波动（Langmuir, 2017, 33, 1826; Macromolecules, 2019, 52, 1327），同时首次通过单分子实验观测到PA66及PA6晶体中高分子链在受力形变过程中多重氢键的动态断裂与重新形成过程，发现高分子链在晶体中滑动过程中进行高速旋转直至氢键重新形成（ACS Macro Lett., 2018,7, 762）。基于上述具有指纹特征的力谱，考察了聚合物链的折叠模式对单分子纳米力学性质的影响规律：非近邻折叠结构的存在会使得力致熔融过程中既包含聚合物链的解折叠又包含无定形链在晶体中的穿行两个过程，导致力学响应信号的叠加。对于锯齿构象的聚合物链，其熔融力曲线体现为小锯齿状平台上面的大锯齿的出现（图3B，3C中的绿色曲线）；对于螺旋构象的聚合物链，非近邻折叠会导致更高力值的长平台力学信号的出现。基于上述信息，该课题组成功地建立了高分子晶体中链折叠模式的定量化研究新方法，该方法无需对样品进行标记，具有很好的普适性，研究结果显示溶液相制备的高分子晶体中近邻规整折叠模式所占比例很高（≥91%），表明分子内相互作用对结晶过程起到了关键作用（ACS Macro Lett., 2019, 8, 1194， ACS Editors’ Choice）。通过化学修饰和条件优化，建立了空气相聚合物单分子力谱方法，显著提升了力学测量精度（从23 pN提升至4 pN）以及拉伸速率（从10 μm/s提高至100 μm/s），并成功检测到PEO折叠链所形成的环形链（loop）结构在晶体中受力运动的中间态（Macromolecules, 2018, 51, 7052）。同时发现晶体所处环境对纳米力学性质影响显著，聚合物与周围介质的界面能越高，熔融力值越高，晶体力学稳定性越好。
图3. 聚合物链在晶体中的折叠模式对其纳米力学性质的影响以及基于力学指纹谱的折叠模式定量化研究。
2. 共价力化学
在极端拉伸条件下，聚合物链有可能会发生分子内共价键的断裂，诱导共价力化学反应的发生。研究外力沿着聚合物链的传递规律，并定量化力化学反应发生的机制是力化学研究的重要内容之一。AFM-SMFS方法是唯一能定量分析力化学反应所需外力及其动力学过程的实验方法，相关研究对于开发新型力色团、调控材料韧性及自修复等性能具有重要的意义。在该展望文章中，作者讨论了相关领域的一些近期研究进展，包括力色团在聚合物主链中的连接方式以及力色团中隐藏的链长对力学性质的影响（Nat. Commun., 2017, 8:1147)、外力诱导螺噻喃可逆开环异构化反应及由此引发的点击化学反应（Nano Res., 2020, 14, 2654）图4），以及外力诱导的聚合物主链释放HCl的反应和由此引发的显色反应(Craig et al., J. Am. Chem. Soc. 2020, 142, 99)等等。
图4. 力诱导螺噻喃异构化及其点击化学反应。
3. 聚合物纳米复合物
了解聚合物与纳米粒子之间的作用强度、影响因素以及复合过程的动力学，对于调控纳米复合物的性质、设计高性能聚合物纳米复合物材料（如，纳米载药体系）具有重要意义。该展望文章评述了以单个聚合物链为探针，采用AFM-SMFS方法研究聚合物与纳米物质形成的复合物的纳米力学性质方面的进展。主要包括，纳米粒子的形状、尺寸及表面电荷密度等对多金属氧簇-聚赖氨酸复合体系相互作用的影响（Langmuir, 2017, 33, 7615）；溶液离子强度对聚阳离子基因载体材料PEI与双链DNA间结合强度的显著影响（ACS Appl. Mater. Inter. 2016, 8, 21055）。还讨论了单股DNA在手性碳纳米管表面进行缠绕组装以及DNA序列、纳米管手性以及盐溶液对所形成的纳米组装体结构及力学性质的影响规律（Nanoscale, 2018, 10, 18586）。在纯水中，DNA与纳米管在π-π及疏水效应作用驱动下缠绕形成螺旋结构；在PBS溶液中，复合物的形成分两步进行：首先是在π-π及疏水效应作用下发生DNA在纳米管上的吸附及缠绕，盐溶液可以消除相邻DNA链段之间的静电排斥作用，从而在氢键驱动下形成更加紧密缠绕的螺旋结构，体现出更高的力学稳定性（图5）。
图5. 盐溶液对单股DNA与手性碳纳米管的组装/解组装过程的影响。
（二）DNA的高级结构及其动态演化
对于一些分子量较大、难以采用核磁及X-射线结晶衍射等方法进行结构解析的聚合物样品体系，通过采用单分子力谱方法并结合CD等传统实验技术，可以较好地研究这些聚合物所形成的高级结构及其动态演化过程。该展望文章分别介绍了其研究组在利用AFM-SMFS方法研究带有重复序列的长链端粒DNA的高级结构及其在外力诱导下的结构演化机制，讨论了DNA样品制备与偶联方法创新对成功开展相关实验的重要性。对双链端粒DNA体系，发现机械力可以触发双链端粒DNA的熔融以及高级结构的形成。只有在两条链都分别形成G-四链体和i-motif结构的条件下，这些四链体结构才能稳定存在，双螺旋DNA的再次复性才能被有效阻止（Nucleic Acids Res., 2020, 48, 6458）。溶液中引入K+、单壁碳纳米管、酸性条件或是富含G的短片段均有利于实现将平衡从双螺旋复性向高级结构形成的方向转移（图6）。上述研究工作为端粒DNA结构的调控提供了一种新的途径和思路。
图6. 双链端粒DNA的动态拓扑结构演化示意图。
对于单股端粒DNA链，首次探测到长串联G-四链体中存在一种新型的不完整折叠结构，即含有G空缺的pre-GQ，其特点是四链体外侧存在多个对称的G空缺（CCS Chem., 2021, 3, 3192）。该长链端粒DNA的折叠过程主要可分为两步，首先快速折叠成G-发夹结构（G-hairpin），接着外侧的鸟嘌呤缓慢地折叠进入到空缺位置形成pre-GQ，较高浓度的PEG可以加快这一过程（图7）。这些发现有助于人们更好地认识长链端粒末端的真实结构，为抗癌药物的设计提供新的思路。
图7. 人类端粒长链ssDNA的动态结构演化示意图。
此外，利用单分子磁镊技术的高的力学精度及系统稳定性，研究了凝血酶适体重复序列所形成的高级结构。采用新开发的换酶滚环扩增法，制备了末端带有多个生物素分子修饰的单股DNA，实现了目标分子在磁球与基片之间的稳定偶联。通过单分子磁镊并结合AFM成像实验，发现长链凝血酶适配体ssDNA内部存在一种由重复序列堆积形成的新型棒状G-四链体结构，且凝血酶的加入可以促进更长的棒状结构的形成（图7，Nanoscale, 2020, 12, 4159）。这项工作所开发的方法原则上适用于基因组中广泛存在的其他重复序列体系的研究。单分子磁镊系统的稳定性及高的力学灵敏度，使其还可以研究由重复序列的DNA与组蛋白所形成的核小体的动态组装、单个聚合物链的结晶成核及链-球（coil-globule）转变等相变过程的研究。
图8. 凝血酶适体重复序列的制备及所形成的新型棒状结构。
（三）前景与挑战
尽管 SMFS在建立聚合物的微观结构（或构象）及其动态结构演变与纳米力学性能和生物功能关系方面展示出广阔的应用前景，但在真实的材料和生物体系研究方面仍有许多问题需要解决。一方面对于聚合物材料体系，单晶的性质不能完全反映复杂体系（同时包含结晶相和无定形相）的真实性质，已建立的力学指纹谱对未来研究非晶相对材料纳米力学性质的影响奠定了坚实的基础。此外，对于非晶聚合物凝聚态的纳米力学性质研究是另一个具有挑战性的课题。通过结合理论模拟、超分辨光谱等技术将有力地促进该领域的发展。另一方面，对于单链力化学领域，SMFS技术仅能提供力和长度信息，难以给出明确的化学信息，通过原位联用其他具有化学组成分辨能力的光谱技术，将赋予SMFS新的活力。在生物体系中，基于AFM的力谱技术尚不能定量外力负载下的化学生物学反应，将SMFS技术和超分辨显微镜进行结合有可能为该课题带来创造性的解决方案。总之，这些领域的发展取决于新技术和新实验/理论方法的建立。这些领域虽然充满挑战，但也为研究人员提供了充分发挥想象力和创造力的空间。
原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.macromol.2c00076
