近日，由西北工业大学生命学院尹大川教授生物大分子研究室和骞爱荣教授骨代谢研究室组成的联合研究团队在RNA递送载体领域取得重要进展。团队研究发现阳离子型高分子聚乙烯胺（polyvinylamine, PVAm）可用于多种RNA的体外和体内递送，具有转染效率高、安全性好、经济性好等优势，相关研究成果发表于药学顶级学术期刊Journal of Controlled Release（2022, 345, 20-37）上。

图1 使用PVAm作为RNA递送载体示意图

  实验中所使用的PVAm为聚N-乙烯甲酰胺（PNVF）的部分水解产物，根据¹H-NMR、FTIR等表征数据，该PVAm约90%的侧链为氨基，约10%的侧链为甲酰胺基（少部分脱水成环），其分子结构式如图1所示；由GPC测得的数均分子量Mn约为57.7kDa，重均分子量Mw约为73.2kDa，由MALDI-TOF MS测得的数均分子量Mn约为65.6kDa。

  PVAm与r/miR-34a在DEPC水溶液中也可形成稳定的纳米复合体PVAm@r/miR-34a；PVAm与siRNA或miRNA在类似条件下均可形成复合体。不同的高分子/RNA质量比条件下形成的PVAm@r/miR-34a复合体的尺寸均小于200nm且尺寸较为均一，具备通过EPR效应进入肿瘤细胞的能力。当PVAm/RNA质量比为1:2和1:1时，纳米复合体表面电荷接近中性，携带微弱的正电荷，既有利于避免血液循环中发生非特异性结合，也有利于复合体进入细胞。相比而言，不同配比的PEI@r/miR-34a颗粒均带有较强的正电荷，在体内易出现非特异性结合，还存在细胞毒性风险。

  透射和扫描电镜可观察到该纳米复合体呈均一规则的球形（图2A）。PVAm@r/miR-34a复合体在不同盐浓度和不同pH环境下尺寸较为恒定，颗粒较小（图2B&C）。相比而言，线型PEI与r/miR-34a仅在特定的盐浓度和pH范围内可形成较小的颗粒，其对环境的适应范围不及PVAm。琼脂糖凝胶电泳的结果显示PVAm和PEI均可在一定浓度比例下紧密结合RNA（图2D），但是在有血清条件下，PVAm@r/miR-34a可稳定存在12小时以上（图2E），而PEI@r/miR-34a仅可稳定约3小时，因此在血液环境中PVAm 对RNA的保护效果优于线型PEI。

  PVAm与r/miR-34a形成稳定纳米复合体，其细胞转染效率在人骨髓瘤143B细胞上进行验证。经PVAm@r/miR-34a处理后，143B细胞内的miR-34a表达量增加超过300倍（图3A），证明其已有效导入细胞，而miR-34a的目标基因所对应的蛋白CDK6和SIRT1的表达量则显著下降（图3B），且比Lipofectamine? 2000和线型PEI载体递送r/miR-34a导致的下降程度更大。

  miR-34a是一种较强肿瘤抑制剂，可抑制肿瘤的生长，还可引发多种肿瘤细胞的凋亡（Cell Death Dis., 2014, 5, e1327）。5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷 (EdU) 染色可进行细胞增殖检测分析，由PVAm将r/miR-34a递送至143B细胞后，EdU染色阳性的细胞显著减少（图3C），显示其增殖受到了强烈抑制，且抑制效率明显高于PEI组。Caspase 3免疫荧光染色显示经PVAm@r/miR-34a处理后的143B细胞凋亡比例显著增高（图3D）。由浓度-抑制率曲线得到的PVAm@r/miR-34a组的EC50值为7.5 nM（图3E），远低于PEI@r/miR-34a组的28.6 nM。综合以上结果，PVAm递送r/miR-34a相比于线型PEI具有更高的体外转染效率和抑制肿瘤细胞增殖的生物学效应。

  为了测试PVAm体内递送RNA的效果，动物实验采用前期实验中成功递送的PVAm@r/miR-34a，动物模型为异种移植143B骨肉瘤小鼠模型，肿瘤细胞接种及PVAm@r/miR-34a经静脉注射系统性给药的时间表见图4A。实验结果显示PVAm@r/miR-34a可显著抑制小鼠骨肉瘤的生长（图4B&C）。作为对照的PEI@r/miR-34a 复合物也一定程度上抑制骨肉瘤的生长，但抑制程度不及PVAm@r/miR-34a，在一只被试小鼠中还出现了肺转移现象。免疫组化结果显示PVAm@r/miR-34a组相比PEI@r/miR-34a组出现了更多肿瘤组织坏死（图4D），且miR-34a的主要标靶SIRT1的表达量得到显著抑制（图4E），显示出较好的肿瘤抑制效果；对动物体重的监测发现PVAm@r/miR-34a组体重无显著减轻（图4F），但采用PEI为递送载体的组体重均显著降低，且出现两只实验动物死亡。综上，PEI在体内实验中体现出显著的副作用，而PVAm作为递送载体更为安全有效。血液生化指标中，PVAm组谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CR）水平均在正常范围内，指示炎症水平的细胞因子白介素6（IL-6）水平与空白对照组相当，显示出PVAm递送系统具备较好的体内安全性，未引起明显的肝肾功能改变和免疫反应。

  为进一步测试PVAm体内递送RNA的效果，RNA采用靶向mmu-Apo脂蛋白B（ApoB-100）的重组siRNA（r/si-ApoB），动物模型为高脂饮食诱导高血脂小鼠模型。从体内递送的结果来看，递送PVAm@r/si-ApoB可以显著降低肝内的脂肪含量（图5A），同时肝内ApoB-100的表达受到显著的抑制（图5B&C），肝内成熟的si-ApoB表达量显著增加（图5D）。此外，递送PVAm@r/si-ApoB可以大幅低高脂饮食小鼠的血脂水平，其中甘油三酯（TG）降低效果最为显著，低密度胆固醇水平也降低至正常饮食小鼠的水平。饲喂高脂饮食11周后连续9周注射PVAm@r/si-ApoB并未引起小鼠体重的明显变化（图5E），血液生化指标中指示炎症水平的细胞因子白介素6（IL-6）水平与空白对照组基本相当（图5F），谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CR）水平均在正常范围内（图5G）。综合以上结果，递送PVAm@r/si-ApoB显示出显著的高血脂治疗效果，短期内具备一定的体内安全性。

  研究结果表明，PVAm可向各类细胞递送不同大小的RNA（siRNA、miRNA和重组RNA等），具有优于目前商品化的Lipofectamine 2000和INTERFERin PEI的转染效果，且细胞毒性较低。以PVAm为载体向异种移植人骨肉瘤小鼠体内递送miR-34a，对肿瘤生长有显著的抑制效果；向高脂饮食诱导高血脂小鼠体内递送si-ApoB，可显著降低小鼠的血脂水平；同时，PVAm递送体系对两种模型动物的肝肾功能均无明显影响，也无明显的免疫原效应。

  此外，PVAm作为一种工业上常用的大宗化学品，其价格远低于现有的商业化RNA载体。因此，本项目的研究成果将为下一代RNA药物研发提供了一种高效、低毒、经济的候选载体。