酶的热效应对于研究生命现象、生理特征具有重要价值。生命活动受到各种生物酶的调控,一方面酶本身的活性受到周围温度影响,另一方面酶催化放热反应释放的热量维持着酶周围环境的温度,研究酶促反应过程中的热量变化具有重要意义。然而,单个酶分子释放的热量很少,热量会迅速扩散到周围环境达到热平衡,现有测量方法如微量热法测量的是整体热平衡后的热量情况,无法实时检测酶分子非平衡放热情况,目前缺乏微纳米尺度热量变化监测的有力工具。
近来,光学纳米温度计的发展为解决上述问题提供了思路。光学纳米温度计是指具有温度响应性的纳米粒子,通常其光学特性会随温度改变,通过测量纳米温度计光学特性变化能获得被测物的温度变化。由于光学信号可以实时获得(采集间隔小于1秒),动态地监测整个放热过程,具有高时间分辨率;而纳米温度计的粒径小于10 nm纳米,其尺寸与一些大分子蛋白质相当,可以实现高空间分辨率。因此理论上讲纳米温度计可以实现生物大分子(如酶)微区域实时非平衡态的温度(热量)变化测量。
图1 酶的微区域温度实时测量示意图
近日,西安交通大学生命学院生物医学影像与应用研究所吴道澄教授课题组提出了一种可以在微纳米尺度下准确、实时监测酶促反应中放热情况的新方法(图1)。文中合成了一种表面带有大量氨基的AgInS2量子点,该量子点的荧光强度具有显著的温度依赖性,荧光强度接近线性地随温度升高而降低,灵敏度为-2.82%°C-1。通过化学交联将量子点紧密地连接到被测物脂肪酶上,确保量子点检测酶周围的温度而不是溶液温度。在连接了量子点的脂肪酶溶液中加入底物,利用荧光分光光度计实时地检测溶液荧光变化,发现随着底物加入溶液荧光强度迅速减弱,经换算脂肪酶最大温差超过溶液6°C,直到底物消耗完才回复到初始值(图2)。该方法具有良好的重现性,最大误差约为4%,温度分辨率约为0.5°C,时间分辨率2秒,可以检测低至0.02 mg/mL的酶溶液。该体系的荧光信号直接代表了酶周围纳米尺度微区域的温度变化,实现了对酶促反应中非平衡放热的检测。这种酶周围热量分布的不均匀性对于研究纳米尺度生物体内的热行为和生物特性具有重要意义。该方法对于研究生物体内各种与热有关的酶过程、线粒体内的热释放甚至肿瘤热疗中的温度反馈都有重要的应用前景。
图2. 酶-量子点复合物在加入底物后的荧光强度变化及对应的温度变化。(a)在Lipase-QDs中加入10μL底物进行三次平行测试,加入10μL PBS作为空白对照,记录荧光强度随时间的变化。(b)在相同Lipase-QDs溶液中加入不同量(5,10,15μL)的底物,记录荧光强度随时间的变化。(c)将b图中前120秒的荧光变化换算为温度变化,以热电偶检测的溶液温度作为对照。(d)在不同温度下的Lipase-QDs溶液中加入相同底物,记录荧光强度随温度的变化。数据以平均值±SD表示(n = 3)。
近日,该成果以“基于温度敏感的氨基-AgInS2量子点的一种准确、实时的酶微区域放热检测方法”(Accurate and Real-time Detection Method for the Exothermic Behavior of Enzymatic Nano-microregions Using Temperature-sensitive Amino-AgInS2 Quantum Dots)为题在国际著名学术期刊Small Methods (IF=14.1)上在线发表,第一作者为西安交通大学生命学院博士生张慧,吴道澄教授为唯一通讯作者,西安交通大学生命学院为该论文的第一和唯一通讯作者单位。该研究成果是吴道澄教授课题组在纳米温度计及其生物应用方面(ACS Appl. Mater. Inter. 2017, 9(12):11073-11081.;ACS Appl. Mater. Inter 2016,8(23):14396-14405.;J. Mater. Chem B. 2019,7,2835--2844.)的又一重要成果。
该工作得到了国家自然科学基金和国家重大科学仪器设备项目的资助。西安交通大学分析测试中心为本工作提供了大量测试表征支持。
论文链接:https://doi.org/10.1002/smtd.202100811
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