在国家自然科学基金重点项目(51833008)和浙江省重点研发计划(2020C01123)的资助下，浙江大学申有青教授团队在核酸和蛋白等生物大分子递送方面近期取得了三项重要进展, 研究成果分别发表在著名学术期刊Advanced Materials（1项）和NanoToday（2项）上。主要研究成果为：1）转染能力不依赖于剂量的聚合物/DNA复合物(Dose-independent transfection of hydrophobized polyplexes, Advanced Materials 2021)；2）能够模拟病毒转染过程、像病毒一样附着在细胞膜上、以膜融合途径将自由的DNA直接注入细胞内的聚合物/DNA复合物(Virus-mimetic DNA-ejecting polyplexes for efficient intracellular cancer gene delivery, NanoToday 2021)；以及3）能够输送蛋白、siRNA等生物大分子的平台技术(Polyplex nanovesicles of single strand oligonucleotides for efficient cytosolic delivery of biomacromolecules, NanoToday 2021)。

1、转染效率不依赖于核酸剂量的聚合物/DNA复合物

  基因疗法在肿瘤治疗、遗传疾病等方面具有良好的应用潜力，其应用瓶颈是高效的核酸递送系统。阳离子聚合物能够中和DNA的负电荷，将其压缩成阳离子聚合物/DNA复合物纳米颗粒，长期以来被广泛应用于核酸药物（如治疗型DNA和mRNA）的体内外基因输送研究，是常用的非病毒基因载体，但由于其在体内的基因转染效率相对病毒载体较低，极大阻碍了其临床应用。 

  新冠等病毒能够在人群中传染，是因为其单个病毒就能完成进入人体并高效感染人体细胞的过程。但是，研究发现阳离子聚合物/DNA纳米复合物的转染能力具有很强的浓度依赖性，其转染能力随稀释而降低并在低浓度时完全失去转染能力。因而当应用于体内系统基因递送时，能够到达靶组织的复合物纳米颗粒很少、浓度低，导致失去转染能力。因此这种浓度依赖性转染限制了阳离子聚合物/DNA非病毒纳米复合物的体内应用。

  针对限制阳离子聚合物转染效率的这一瓶颈问题，浙江大学申有青教授团队的张震博士和邱娜莎博士合成了具有一系列结构类似但疏水性可调的聚甲基丙烯酸酯类聚合物（图1a），详细研究了其DNA转染效率的规律，发现复合物的稳定性和内吞途径决定了其转染是否有剂量依赖性（图1b）：亲水性的阳离子聚合物与DNA形成的复合物是动态的，在低浓度时，该复合物颗粒会解离，剩余的小部分被内吞入溶酶体；溶酶体内过低浓度的阳离子聚合物无法引起“质子海绵效应”而无法释放出DNA，导致失去转染能力。通过系统研究阳离子聚合物疏水性与DNA转染能力之间的关系发现，具有适当疏水性的阳离子聚合物与DNA形成的复合物，即使在低浓度下仍然保持了完整性，且能够通过巨胞饮的方式进入高通透性的巨胞饮体，并直接进入胞浆，从而避开了溶酶体陷阱。因此，即使在低浓度下每个复合物仍然能够独立完成其感染细胞的过程，实现类似于病毒载体的非剂量依赖型DNA转染。

  更进一步，该疏水性聚合物形成的复合物与阴离子聚谷氨酸(γ-PGA)可通过静电相互作用产生的吸引力与其疏水性/γ-PGA亲水性产生的斥力相平衡，使γ-PGA既可以在复合物表面形成一个遮蔽层，又可以在接触细胞膜时高效剥离下来，释放出聚合物/DNA复合物纳米颗粒进行非剂量依赖型转染。这些发现可以为设计模拟病毒载体的高效体内基因递送系统提供指导意义。该工作近期以Dose-independent transfection of hydrophobized polyplexes发表在于 Advanced Materials .

图1.结构类似但疏水化程度不同的阳离子单体结构及其聚合物（a），及不同疏水性复合物的基因转染行为和基因转染途径（b）。b）：i) 高亲水性的A100/DNA复合物通过网格蛋白介导的内吞途径进入溶酶体；在高复合物浓度下，内涵体/溶酶体含有大量复合物以裂解内涵体，释放DNA进入胞浆实现基因转染；但在低浓度下大部分复合物溶胀解离，剩下的部分复合物进入内涵体/溶酶体，这些复合物浓度不足以诱导内涵体/溶酶体裂解，从而丧失转染能力。ii) 较疏水性的B75D25可以与DNA复合形成稳定的纳米颗粒，即使在非常低的浓度下仍然能够保持完整性，且可以通过巨胞饮的方式进入渗漏型的巨胞饮体，很容易逃逸至胞浆，实现剂量非依赖性转染。iii) B75D25/DNA复合物与γ-PGA通过平衡的亲和力，形成具有核壳结构的γ-PGA/B75D25/DNA 纳米复合物用于体内抑瘤。与细胞膜接触后，γ-PGA的外壳脱落下来，释放B75D25/DNA 复合物实现有效转染。

  原文链接：https://doi.org/10.1002/adma.202102219

2、仿病毒膜融合基因“注入”型纳米复合物

  现有的阳离子聚合物/DNA复合物纳米颗粒需要通过细胞內吞途径进入细胞后，再在胞质释放携载的DNA进行转录表达，导致进入细胞的阳离子基因载体及其降解产物与胞质组分（如参与转录和翻译的酶、转录因子和tRNA等生物活性物质）产生非特异性地黏附，不仅会扰乱DNA的转录过程，降低转染效率，还会导致细胞毒性。此外，阳离子聚合物和DNA分子量都很大，大量的正/负静电相互作用使得复合物纳米颗粒在热力学上非常稳定，使其难以与DNA快速解离，进一步降低了阳离子聚合物的转染效率。与之相比，病毒载体（例如噬菌体、腺病毒等）能够附着在细胞膜上并对其打孔，从而将携载的基因组直接通过孔洞“注入”宿主细胞的胞质溶液中（图 2a），既有效地避开了溶酶体陷阱造成的DNA降解，又能够防止载体本身进入细胞对基因转录造成干扰，因此具有极高的转染效率。但是，病毒载体的生物安全性较差，容易导致机体产生严重的免疫反应和系统毒性，显著限制了它的临床应用。 

  针对上述问题，团队王国伟博士和陈思亲博士综合融汇了病毒载体和非病毒载体的优点，设计了一种肿瘤特异性酯酶触发电荷反转型阳离子聚合物（L4），成功构建了一种仿病毒膜融合、基因注入型基因输送体系（L4/DNA纳米复合物）。通过合成一系列具有不同烷基侧链和不同亲疏水性的酯酶触发电荷反转型阳离子聚合物（图 2b），筛选出了具有仿病毒膜融合特性的高效基因输送载体——L4。L4与带负电的DNA能够自组装形成结构稳定的L4/DNA复合物纳米颗粒（图 2c, i），表面修饰γPGA能够显著提升其血浆稳定性和体内应用（图 2c, ii）。该体系具有仿病毒膜融合型高效基因转染特性的设计关键点之一，在于L4具备适宜长度的辛酰基侧链，使其能够稳固地锚定细胞膜并插入磷脂双分子层中，将复合物纳米颗粒固定在细胞膜上并使其部分暴露于细胞浆（图 2c, iii）。该载体设计的关键点之二，是利用了细胞浆内含有大量的酯酶能够快速水解L4中的酚基酯，并进一步触发自催化酯键水解反应产生带负电的聚丙烯酸，从而解离释放DNA（图 2c, iv）；与此同时，聚丙烯酸与DNA自身的强静电互斥作用，能够将DNA直接“注入”细胞质中实现高效的基因转染（图 2c, iv）。

  因此，通过载体的电荷反转和膜融合的设计，γPGA/L4/DNA基因输送体系成功融合了病毒载体和非病毒载体的优点，使其与肿瘤细胞接触后能够以仿病毒膜融合的基因递送形式，将携载的DNA直接“注入”细胞质中进行转录，不但规避了细胞內吞的阳离子载体造成的细胞毒性和对基因转染的干扰，而且防止了溶酶体陷阱导致的DNA降解。该基因输送系统为进一步开发模拟病毒载体的高效体内基因递送系统提供了指导基础。相关研究成果以“Virus-mimetic DNA-ejecting Polyplexes for Efficient Intracellular Cancer Gene Delivery”为题，于2021年6月11日发表于Nano Today上。

图 2. 膜融合基因“注入”型纳米复合物示意图。(a) 许多病毒通过膜融合途径将基因组“注入”宿主细胞中。（b）具有不同烷基侧链的酯酶触发电荷反转型阳离子聚合物的化学结构及其电荷反转机理。（c）γPGA/L4/DNA的制备方法及基因输送途径：DNA被L4压缩成结构稳定的复合物纳米颗粒后i)，用γPGA包被 ii)；一旦接触细胞，γPGA可以剥离并暴露 L4/DNA，然后 L4 的长酰基链插入脂质双层并将 L4/DNA 锚定在细胞膜上 iii)；部分朝向细胞质的 L4 被胞质酯酶触发电荷反转而产生负电荷iv)，从而通过强静电互斥作用将 DNA挤压“注入” 细胞内实现高效的基因转染。 

  原文链接：https://doi.org/10.1016/j.nantod.2021.101215

3、基于单链寡聚核苷酸的聚合物纳米囊泡用于生物大分子输送

  向细胞内高效递送具有治疗功能的基因或蛋白质等生物大分子是当今生物医学领域研究的热点，而安全高效的生物大分子递送系统是其应用的瓶颈。阳离子聚合物是广泛研究的非病毒载体，但普通的阳离子聚合物（如PEG-PLL）等难以与短链、刚性的siRNA和电荷密度低且分布不均的蛋白形成稳定、输送效率高的纳米颗粒。虽然提高阳离子电荷密度可解决这一问题上，但高电荷密度显著提高载体的细胞毒性。浙大申有青教授团队周泉博士（现为浙大基础医学院研究员）和相佳佳博士发现链结构柔顺、分子量相对较小的单链寡聚核苷酸，与PEG-PLL可形成复合物纳米囊泡，能够高效负载多种蛋白和siRNA，并将其高效地输送到细胞内（图3a）。用含20个氟尿嘧啶单元的功能性寡聚核苷酸单链F20，与PEG-PLL构建囊泡F20some，并对其蛋白和siRNA体内外输送特性进行了系统研究，同时输送F20和具有协同作用的siRNA或者功能蛋白，获得了高抗肿瘤活性的纳米制剂（图3b）。

  该方法中单链核苷酸可为如适配子（Aptamers）、CpG甚至microRNA等各种核苷酸序列，因而是一个普适、高效、低毒的基因和蛋白等大分子输送平台。但如何进一步提高该囊泡在生理环境中的稳定性依然是未来研究的重点。该工作以Polyplex nanovesicles of single strand oligonucleotides for efficient cytosolic delivery of biomacromolecules 发表在近期 Nano Today上。

图3. （a）基于单链寡聚核苷酸的聚合物纳米囊泡的构建；（b）以F20作为功能型寡聚核苷酸单链构建纳米囊泡F20some，并选取siBCL-2和RNase A作为模型siRNA和蛋白，研究了F20some对siBCL-2和RNase A的胞内递送效果和细胞内的协同凋亡作用。

  原文链接：https://doi.org/10.1016/j.nantod.2021.101221