β-多肽由β-氨基酸通过肽键连接而成，具有与天然多肽（α-多肽）相似的结构、优异的生物相容性和抗蛋白酶水解的优点。自1996年Gellman教授首次用β多肽成功模拟了天然多肽的二级结构以来（J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 13071; Nature 1997, 387，381） β-多肽逐渐被广泛用于天然多肽结构和功能模拟，以及在蛋白折叠、药物开发、生物材料等领域的应用研究。β-多肽在体内的稳定性是开展相关研究的突出优势之一，例如被用于研究解决天然多肽类药物体内稳定性差、生物利用度低的显著缺点。β-多肽的合成，除了传统耗时耗力的逐步固相合成法，β-内酰胺（β-lactam）开环聚合是目前最常用的β-多肽快速合成方法。但是，β-lactam开环聚合的强碱性反应环境限制了对碱不稳定的功能基团和β-多肽的结构多样性和应用，且聚合反应对水极为敏感，需要使用干燥溶剂在手套箱中操作；无法实现C-端可控官能化和N-/C-两端同时可控官能化。

  刘润辉教授课题组致力于解决上述β-多肽合成的核心问题和挑战，建立了反应条件温和、对水分不敏感的β-氨基酸N-硫代羧基酸酐（β-NTA）开环聚合，以伯胺作为引发剂实现了可在敞口容器中制备可控二级结构β-多肽的突破性进展，摆脱了对手套箱和干燥溶剂的依赖。

  以侧链含酯基的β-多肽poly（Bn-β³-LCHG）合成为例，比较β-lactam开环聚合和β-NTA开环聚合两种方法，通过¹H NMR和MALDI-TOF-MS表征发现：β-lactam聚合只能回收到侧链苄酯基消失的副产物；而β-NTA聚合得到了侧链苄酯基完好的目标产物β-多肽。进一步通过合成侧链含有不同功能化基团的β-NTA单体，展示了对水分不敏感、可在手套箱外敞口容器中进行的β-NTA开环聚合反应，制备了各种不同链长（DP=10-505）、低分散性（?=1.07-1.31）的β-多肽均聚物以及无规和嵌段共聚物（图1）。

图1. (a) β-lactam和β-NTA 开环聚合对比；(b) β-lactam聚合制备poly（Bn-β³-LCHG）的表征；(c) β-NTA聚合制备poly（Bn-β³-LCHG）的表征；(d) 伯胺引发不同侧链的β-NTA聚合。

  论文还展示了在敞口容器中10克级的β³-HPhG NTA聚合反应，并顺利得到5.6 克（76.5%收率）的目标产物多肽poly（β³-HPhG）。MALDI-TOF-MS表征验证了通过伯胺引发剂引入β-多肽C-端的官能团（对叔丁基苄胺）。对比在手套箱中氮气保护条件下的β-NTA聚合，手套箱外敞口容器中进行的β-NTA聚合能够得到相同稳定二级结构的目标多肽（图2）。

图2. (a) 10克级的β³-HPhG NTA敞口聚合展示；(b) 10克级的β³-HPhG NTA聚合产物的MALDI-TOF-MS表征；(c) 敞口聚合得到的不同链长的poly（Cbz-β²-LDAP）的圆二色谱表征。

  论文进一步探究了β-NTA开环聚合的机理。首先，引发剂伯胺与β-NTA环上的羰基进行亲核加成，β-NTA开环后释放COS分子生成新的末端为伯胺的中间体并继续与β-NTA反应实现链的增长（图3a）。通过分析引发剂和单体1：1混合物的质谱，发现生成的末端为伯胺的中间体结构（图3b）；同时，MALDI-TOF-MS表征证实了正己胺引发得到的聚合产物多肽C-端的正己胺基团，进一步支持了上述聚合机理（图3c）。

图3. (a) 提出伯胺引发β-NTA聚合的机理；(b) Bn-β³-LCHG NTA:正己胺（1:1）混合物的高分辨质谱表征；(c) 10 克级的β³-HPhG NTA聚合产物的MALDI-TOF-MS表征；(d) 敞口条件下的Bn-β³-LCHG NTA:正己胺（10:1）的聚合产物的MALDI-TOF-MS表征。

  目前广泛应用的β-lactam开环聚合制备β-多肽方法的一个显著缺点是无法实现C-端可控官能化和N-/C-两端同时可控官能化；本研究展示了β-NTA开环聚合方法制备多肽可完美地解决这一问题。通过模拟式宿主防御肽作为研究对象，用端基伯胺的荧光染料（Dye-NH₂）引发β³-HPhG NTA和Cbz-β²-LDAP NTA混合单体的共聚，顺利获得C-端荧光基团修饰的多肽，并通过原位与N,N-二（2-吡啶甲基）甘氨酸（DPA）反应获得N-/C-两端同时可控官能化的β-多肽（Dye-peptide-DPA）（图4a）。本论文还通过多肽抗菌机理研究和增强多肽抗菌功能研究两方面，初步展示了N-/C-两端同时可控官能化的重要意义和潜在应用价值（图3b-d）。鉴于伯胺引发β-NTA开环聚合的突出可控性，作者还展示了通过逐步向反应体系中加入聚合单体的逐步聚合反应，并顺利得到粗产率为71.8％的结构精确的β-六肽。

图4. (a) 模拟宿主防御肽的4-吗啉基-1,8-萘酰亚胺染料（Dye）和N,N-二（2-吡啶甲基）甘氨酸（DPA）双功能化的β-多肽（Dye-peptide-DPA）合成；(b) DPA功能化后的β-多肽对B. sub的抗菌活性影响；(c) 在PI存在下的Dye-peptide-DPA 杀死细菌过程中的confocal图片，Scale bar, 1μm；(d) 12.5 μg/mL 的Dye-peptide-DPA 处理B. sub前后的SEM图片；(e) 敞口条件下Methyl-PEG₄-NH₂引发β-NTA逐步聚合反应制备混合序列β-多肽。

  本研究所建立的摆脱对手套箱和干燥溶剂依赖的反应条件温和、对水分不敏感的β-NTA开环聚合制备β-多肽合成方法，将会拓展β-多肽的结构多样性和可控二级结构多肽的制备及功能和机理研究。简便的合成操作也为多肽相关领域非有机合成背景研究人员提供了更加友好和容易掌握的合成方法，在医药、组织工程、生物材料、生物学和化学等诸多领域具有广阔应用前景。该研究成果以题为“Water Insensitive Synthesis of Poly-β-Peptides with Defined Architecture”发表在《德国应用化学》（Angewandte Chemie International Edition）。

  华东理工大学材料科学与工程学院博士生周敏是该成果的第一作者，华东理工大学刘润辉教授是唯一通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金委、科技部等基金的资助。

  论文链接: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202001697