在医疗卫生和农渔畜牧业领域，近几十年来每年都有大量的抗生素被用来抗击细菌感染。全世界抗生素的用量在2010年就达到了每年十至二十万吨，而且多达90%使用的抗生素会以各种活性形态直接释放到自然环境之中。因为抗生素的自然降解过程非常缓慢，在世界各地的土壤和水源里都检测到了非同寻常的高浓度人造抗生素。很多证据表明在生态环境中累积的人造抗生素垃圾正在带来严重后果， 包括对负责生物地化循环和有机降解的微生物群落的结构和功能的短期和长期不良影响，污染食物链中的水源和动植物产品，以及促进抗药基因库的发展等等。解决这个问题的办法大体分为两类， 一类是开发能在体内生物降解的抗生素， 但是在使用中不断降解失活的抗生素本身会助长抗药细菌的进化；另一类是采用新型污水管理办法来减少，捕捉， 或者分解抗生素，但是这类办法的实际操作比较困难， 因为要涵盖抗生素垃圾的多样释放途径和巨大释放规模是一个几乎不可能的任务。理想抗生素应该在临床应用上保持全额活性，但是当释放到自然生态环境中会迅速降解失活。没有一种现在使用的抗生素具有这种特性。

  梁红军教授课题组近年来在研究模拟嗜菌体抗生素的工作中发现了亲水纳米的大小和形状在界定抗菌活性和选择性方面的重要作用（ACS Infect. Dis., 3(9), 676-687 (2017); C&EN, 95 (35), 9 (2017)）。再此基础上，本项工作提出了一种基于纳米结构的智能抗生素新概念来设计能“组装激活”并响应自然生态环境特有信号而“解散失活”的纳米抗生素，并且阐述了这种亲水纳米粒子选择性的进攻细菌而不是动物细胞的分子原理。

图1. 自带能响应自然生态环境特有信号而“解散失活”的纳米抗生素

  这种抗生素由基于纤维素的棒状纳米高分子刷组成（图1）。构成刷子的亲水高分子本身（PTMAEMA；poly(N,N,N-trimethylamino-2-ethyl methacrylate)）没有溶血效应和杀菌活性。通过原子转移自由基聚合反应把PTMAEMA接枝到纤维素骨架上而形成的亲水棒状纳米高分子刷既没有溶血或凝血效应，也对人类胚胎肾细胞没有毒性，但是能在低剂量（4-32 μg/mL）下有效杀灭（>99.9%）大肠杆菌 （E. coli.），金黄色葡萄球菌（S. aureus）和临床上提取的抗药菌种，包括抗妥布霉素和庆大霉素的铜绿假单胞菌（PA14），以及抗甲氧西林，奥沙西林，和万古霉素的金黄色葡萄球菌（MU50）。在模拟自然生态环境中处处发生的纤维素酶解实验中，基于纤维素的棒状纳米高分子刷迅速瓦解而失去纳米结构， 它们的高效抗药活性也随之而去。因为纤维素酶只存在于自然生态环境而非人体之中，这种环境降解而非生物降解的智能抗生素会在临床应用上保持全额活性，但是当释放到自然生态环境中会迅速降解失活，因而不会变成抗生素垃圾而造成环境污染。

图2. 纳米结构是亲水高分子刷引起细菌细胞膜破裂的关键

  为了阐述亲水纳米抗生素的杀菌原理，课题组设计了一系列对比实验证明了纳米结构是引起的细菌细胞膜破裂而杀灭细菌的关键。用于检测细胞膜完整与否的憎水荧光分子渗透分析（图2a）和细胞质泄漏鉴定（图2b）均显示只有抗菌活性的纳米高分子刷能造成细菌细胞膜破裂。与之相反，没有抗菌活性的纳米高分子刷酶解产物或构成刷子的亲水高分子本身都不会影响细菌细胞膜保持完整。扫描电镜也显示革兰氏阴性的大肠杆菌在纳米高分子刷酶解产物（图2e）或构成刷子的亲水高分子本身（图2f）的存在下均不会改变原生形态（图2c），而在同等剂量的纳米高分子刷的存在下细胞膜则完全碎裂（图2d）。对于革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌，由于其细胞膜外有厚厚的肽聚糖保护层，扫描电镜不会探测到细胞形态的明显变化 （图2g-j），但截层透射电镜清晰地观测到原生细菌里经氧化锇上色的完整细胞膜（图2k，白色箭头所示）不会在没有抗菌活性的纳米高分子刷酶解产物（图2m）或构成刷子的亲水高分子本身（图2n）的存在下发生变化。与之相反，这些细胞膜在与具有高效抗菌活性的纳米高分子刷的作用下则完前消失（图2l）。

  亲水纳米粒子选择性地破坏细菌细胞膜而不损害动物细胞膜的行为表明细胞膜的化学结构也扮演了重要的辅导角色。细菌和动物细胞膜的一个显著差别是组成细胞膜的脂质分子有别，前者主要由负曲率的脂质分子组成，而后者的主要成分为零曲率的脂质分子。在荧光共聚焦显微镜下，模拟动物细胞的巨囊泡在纳米高分子刷，高分子刷酶解产物， 或构成刷子的亲水高分子作用下均不会释放其包载的荧光素（图3a）。这一结果显示不管有没有纳米结构，亲水高分子不会破坏动物细胞膜。当这些巨囊泡膜里的零曲率脂质分子被置换成负曲率的脂质分子来模拟细菌细胞时，虽然高分子刷酶解产物或构成刷子的亲水高分子本身也不会使其释放包载的荧光素，具有纳米结构的高分子刷则会导致荧光素快速泄漏（图3b）。这一观测再一次表明亲水纳米粒子会选择性地破坏细菌细胞膜， 而这种选择性与细胞膜的脂质分子组成有关。

图3. 亲水高分子与模拟细菌及动物细胞脂质体之间的自组装行为高度依赖于纳米结构

  亲水高分子与动物或细菌细胞膜相互作用的微结构差别在同步辐射小角x-光散射下一目了然。纳米高分子刷，高分子刷酶解产物， 或构成刷子的亲水高分子本身均会通过静电吸引粘着在模拟动物细胞的脂质体表面而形成松散的叠层结构，显示细胞膜的完整性没有受到影响（图3c）。与之相反，高分子刷酶解产物或构成刷子的亲水高分子本身与模拟细菌细胞的脂质体作用会形成三维立方膜结构（图3d，e），而纳米高分子刷则与模拟细菌细胞的脂质体作用而形成简单的二维六方膜结构（图3d，f）。因为只有纳米高分子刷可以破坏细菌细胞膜，一个合理的推测是只有二维六方膜结构才能导致不可逆的细菌细胞膜破裂。

图4. 基于同步辐射小角x-光散射的傅立叶重建揭示了亲水纳米高分子刷选择性地攻击细菌细胞膜而成孔的分子原理

  傅立叶重建揭示了由于二维六方膜结构的形成而导致细菌死亡的分子原理。亲水纳米高分子刷与细菌细胞膜相互作用后的膜表面电子密度分布图清楚地显示了二维六方膜是一种六方排列的膜孔结构（图4a）。对沿着晶胞轴剖面方向的一维电子密度分布图地分析进一步确认了分子水平的成孔原理（图4b）：相邻膜孔中间区域对应典型的脂质分子烃链结构；在膜孔正中的高电子密度区被归属为高分子刷；环绕高分子刷的一圈次高电子密度的物质被归属为磷脂亲水端基。傅立叶重建清晰地揭示了亲水纳米高分子刷选择性地攻击细菌细胞膜而成孔的分子原理（图4c）。这种蜂窝形态的反转六方结构是膜孔的标志。由于膜孔形成而导致的细菌内环境失衡引发了不可逆的细菌细胞膜碎裂，这也是亲水高分子刷杀灭细菌的根因。纳米结构在帮助亲水高分子刷获得抗菌活性上起到了决定性的作用，因为只有由纳米结构衍生的多价相互作用才能引发细菌细胞膜包裹弯曲在纳米结构周围形成膜孔。失去纳米结构的高分子刷酶解产物或者构成刷子的亲水高分子本身均不会引起细菌细胞膜的这种拓扑构造的变化，从而也失去了杀菌活性。另外，这种由纳米结构引起的细胞膜拓扑构造的变化只适用于细菌而不适用于动物细胞，因为只有细菌细胞膜内含有大量负曲率的脂质分子，它们帮助抵消了把细胞膜沿着纳米结构弯曲成孔所需要的自由能。与之相反，因为动物细胞膜的主要成分是零曲率的脂质分子，它们更倾向于形成平直而不是弯曲的膜结构，同样的成孔机制会因为所需的自由能太大而不可能实现。

  综上所述，本项工作阐述了一种设计基于纳米结构的智能模块化抗生素的新概念。无毒也无杀菌活性的亲水高分子在组装成纳米高分子刷后会变成无毒但有高效杀菌活性的抗生素。这种由“组装激活”的杀菌特性也会随纳米结构解散而消失。纳米结构是“打开”或“关闭”杀菌活性的关键。这一发现使开发能响应自然生态环境特有信号（比如纤维素酶）而“解散失活”的环保抗生素变为可能， 从而为减少人造抗生素垃圾造成的生态污染提出了新的解决思路。  

  本研究的相关结果已发表于Biomacromolecules，入选ACS Editors'' Choice，并得到了化学与工程新闻的突出报道（C&EN, 04/14/2020,“Bottle-brush antibiotic busts bacterial membranes”, Vol 98, No. 15）。本项目得到了美国国家科学基金 (NSF DMR-1810767), South Plains基金，及CH基金 的经费支持。

  论文链接：https://doi.org/10.1021/acs.biomac.0c00163