严重的创伤、先天性畸形或肿瘤切除导致的临界尺寸骨缺损修复是临床的一大难题。尽管当前骨组织工程支架(BTES)取得了巨大进步,但其治疗效果仍然有限。大多数BTES侧重于刺激干细胞活性和提供成骨功能,忽略了动态改善骨缺损微环境的需要。在临界骨缺损微环境中,出血、细菌感染、炎症反应和成骨受损等级联信号在不同程度上损害了骨再生。这要求BTES具有精准的调控逻辑以顺序响应复杂、动态的病理线索,执行相应的治疗策略,级联调控骨再生过程。然而,现有的BTES都不满足临界尺寸骨缺损的级联再生需求。
鉴于此,浙江省人民医院孙燚团队与福州大学张进教授团队合作,把BMP-2衍生多肽(BP)与蜂窝二氧化锰纳米酶(BHM)偶联,并掺入由L-精氨酸修饰的甲基丙烯酸羧甲基壳聚糖(CMAA)和富含酚羟基的没食子酸接枝的甲基丙烯酸明胶(GMAG)中,制备得到多功能一体化水凝胶(BHM@CG)。在BHM@CG水凝胶植入缺损部位后,首先通过多酚基团与骨组织中胺键、酰胺和硫醇之间的强粘附实现快速的组织整合与止血。随后,羧甲基壳聚糖阳离子氨基的质子化效应、以及没食子酸的酚羟基氢键和疏水作用协同高效杀菌。同时,BHM纳米酶和多酚基团有效消除活性氧(ROS),促进巨噬细胞由M1向M2极化,实现了炎症调控。最后,BHM@CG水凝胶中没食子酸、氧气(O2)、精氨酸、BP和锰离子(Mn2+)的持续释放促进了细胞迁移、血管生成和成骨。体内实验结果表明,第8周时,BHM@CG水凝胶在大鼠临界尺寸颅骨缺损模型中实现了近40%的新骨形成率。值得注意的是,该水凝胶在感染的临界尺寸颅骨缺损模型中也展现出有效的抗菌和骨再生能力。总之,该水凝胶可动态调节骨缺损微环境,实现“快速止血?高效杀菌?消除炎症?加速成骨”四阶段级联调控骨再生,为临界尺寸骨缺损修复提供了一种有前景的策略。
该研究近期以“Bone Morphogenetic Protein-2?Derived Peptide?Conjugated Nanozyme-Integrated Photoenhanced Hybrid Hydrogel for Cascade-Regulated Bone Regeneration”为题发表在《ACS Nano》上。
图1 BHM@CG水凝胶具有快速止血、高效杀菌、消除炎症和加速成骨能力,可动态级联调节大鼠临界尺寸颅骨缺损模型中的骨再生。
【BHM纳米酶的制备及物理性能表征】
透射电子显微镜和扫描电子显微镜(SEM)图像显示,BHM纳米酶具有蜂窝状球形结构,且BP的负载未改变BHM纳米酶的微观形态(图2A)。粒径分析显示BHM纳米酶尺寸增加(图2B)。Zeta电位分析表明BHM纳米酶相比HM纳米酶有所升高(图2C)。进一步地,傅里叶变换红外光谱和X射线光电子能谱验证了BP的成功负载(图2D,E)。如图2F,G所示,HM和BHM纳米酶在H2O2清除与O2生成方面均表现出浓度依赖性。BHM纳米酶的药物负载率良好,接近50%(图2H)。药物释放实验表明,在1 mM H2O2刺激下,BP释放量达到61.2% ± 3.2%,与无H2O2刺激条件相比增加了2.9倍,表明BHM纳米酶具有H2O2刺激响应释放特性(图2I)。此外,与H2O2反应后,BHM纳米酶中的HM可进一步分解为Mn2+(图2J)。
图2. BHM纳米酶的物理性能表征。
【BHM@CG水凝胶的形貌与物理性能】
研究人员对水凝胶的形貌与物理性能进行了评估。四组水凝胶均在紫外光交联下实现了原位形成,且BHM@CG水凝胶的凝胶化时间显著短于CMAA水凝胶(图3A,B)。SEM结果表明BHM@CG水凝胶的网络交联紧密,具有厚孔壁的高度多孔结构(图3C)。通过流变学和压缩测试对BHM@CG水凝胶的机械性能进行了研究。流变实验结果说明双互穿网络提升了CG和BHM@CG水凝胶的刚性(图3E)。压缩测试进一步表明CG水凝胶的弹性模量显著高于CMAA和GMAG水凝胶,而BHM纳米酶的加入对BHM@CG水凝胶的弹性几乎没有影响(图3F,G)。此外,研究人员在磷酸盐缓冲溶液(PBS)或酶存在下评估了CG水凝胶的体外降解动力学。CG中的聚合物,包括明胶和CMC,可以分别被内源性酶如胶原酶和溶菌酶生物降解。CG水凝胶在PBS溶液中降解缓慢,而胶原酶或溶菌酶加速了降解过程(图3H)。而对于溶胀测试,所有水凝胶可在12 h内溶胀至平衡(图3I)。
图3. BHM@CG水凝胶的理化性能表征。
【BHM@CG水凝胶在大鼠颅骨临界骨缺损中的成骨性能评估】
研究人员建立了大鼠临界尺寸颅骨缺损模型进一步评估其在体内的成骨效果(图4A)。如图4B?D所示,通过微型计算机断层扫描(micro-CT)重建新生骨的形态特征。在BHM组中,术后4周和8周观察到的新生骨组织极少, CG组的成骨诱导能力优于对照组和BHM组,相比之下,BHM@CG组在缺损区域周围的新骨形成显著增加,形成的骨桥几乎完全覆盖了缺损部位。值得注意的是,随着修复时间的延长,BHM@CG组的促成骨能力越来越明显。为了进一步评估骨再生情况,进行了苏木精-伊红染色和Masson三色染色(图4E,F)。在对照组和BHM组中,纤维组织主要占据缺损部位,而新生骨组织极少。相比之下,水凝胶实验组表现出更明显的新骨形成,其中BHM@CG组在术后4周和8周均表现出最显著的成骨活性。
图4. BHM@CG水凝胶在大鼠颅骨临界骨缺损中的成骨性能评估。
论文共同第一作者为浙江省人民医院陈家鑫医师、赵烨医师,以及福州大学化工学院博士生阮任杰。通讯作者为浙江省人民医院孙燚副主任医师,福州大学化工学院张进教授,以及浙江省人民医院王吉研究员。
该工作得到科技部国家重点研发计划青年科学家项目、中国科协青年人才托举工程、国家自然科学基金、福建省自然科学基金杰青项目、浙江省自然科学基金、浙江省医药卫生科技计划、浙江省中医药科技计划、浙江省教育厅科研项目、福建省雏鹰计划青年拔尖人才项目、福建省泉州市高层次人才创新创业计划等基金的资助。
原文链接:https://doi.org/10.1021/acsnano.4c13690.
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