东华大学沈明武研究员/史向阳教授团队：铜掺杂层状双金属氢氧化物共递送蛋白/药物调控肿瘤双重代谢实现级联的化学动力学/免疫治疗

2025-02-08 来源：高分子科技

代谢重编程是癌症的重要特征之一。肿瘤细胞的特定代谢途径及其在肿瘤微环境（TME）中积累的代谢产物大大限制了效应T细胞对肿瘤细胞的免疫监视和杀伤能力。靶向TME改变肿瘤代谢途径被认为是下一代癌症治疗的理想策略。研究表明，TME中乳酸的积累不仅促进了肿瘤的生长、侵袭和转移，还削弱了效应T细胞和自然杀伤细胞的功能，并促进了巨噬细胞的M2型免疫抑制表型转化，从而建立了免疫抑制微环境。令人鼓舞的是，已被开发的调节乳酸代谢策略，能够逆转免疫抑制微环境，激活免疫系统。

纳米递送系统为改善蛋白质和小分子药物的递送效率提供了一种新的策略，在改变肿瘤和免疫细胞的代谢途径方面展示出良好的应用潜力。研究显示，通过纳米载体递送乳酸氧化酶（LOX）或乳酸外排抑制剂来调节乳酸代谢，并结合声动力治疗、光热治疗或化疗等策略显示出良好的抗肿瘤效果。相关研究显示乳酸作为关键代谢靶点，为激活免疫治疗提供了一种新的可行策略。然而，当前的乳酸代谢治疗策略主要集中在减少乳酸含量，设计能够同时耗竭TME中乳酸并利用其降解产物过氧化氢（H₂O₂）增强肿瘤治疗的纳米药物可大大提高肿瘤治疗效果。此外，由于肿瘤细胞的代谢具有高度的可塑性，将乳酸代谢调节与其他代谢途径结合起来靶向多条代谢途径有望实现更高效的代谢调控治疗。

肿瘤细胞的氧化还原代谢被认为是肿瘤治疗的一个有效靶点。基于金属离子介导的芬顿或类芬顿反应的化学动力学治疗（CDT）是调节肿瘤氧化还原代谢平衡实现肿瘤治疗的典型代表。其原理是通过将H₂O₂转化为更具毒性的羟基自由基（?OH），从而诱导肿瘤细胞凋亡。尽管CDT具有良好的应用潜力，但是肿瘤内低浓度的H₂O₂限制了?OH的持续产生。另外，细胞内高水平的还原性物质谷胱甘肽（GSH）则会捕捉生成的?OH，限制了CDT的治疗效果。因此，构建能够提高H₂O₂含量并降低GSH水平的纳米药物是提高CDT效率的关键。层状双金属氢氧化物（LDH）是一种典型的二维无机纳米材料，具有合成简便、易于掺杂二价和三价金属离子、对pH敏感和良好的生物相容性等特点，在肿瘤的诊断及治疗领域显示出良好的转化潜力。

基于此，东华大学沈明武研究员/史向阳教授团队设计了一种简单的Cu²⁺掺杂LDH纳米平台，共递送单羧酸转运蛋白抑制剂双氯芬酸（DC）和LOX，用于乳酸代谢和氧化还原代谢的双重调控，旨在实现级联增强的化学动力学/免疫治疗（图1）。首先，通过共沉淀法合成了LDH-DC纳米颗粒，随后通过静电相互作用将LOX负载到LDH-DC纳米颗粒的表面，进而获得LDH-DC-LOX纳米药物。

图1、LDH-DC-LOX纳米颗粒的制备及其用于调节乳酸和氧化还原代谢诱导级联的化学动力学/免疫疗法。

本研究合成的Cu²⁺掺杂LDH粒径大小约为50 nm，Cu²⁺掺杂并负载DC的LDH-DC纳米颗粒大小约为55 nm（图2A-B）。SDS-PAGE分析、紫外光谱分析、红外光谱分析表明DC和LOX被成功负载到Cu²⁺掺杂LDH纳米平台（图2C-E）。水合粒径测试显示LDH-DC-LOX纳米药物具有良好的胶体稳定性（图2F）。此外，LDH-DC-LOX高效保留了LOX催化活性，能够催化乳酸产生H₂O₂（图2G）。掺杂的Cu²⁺能够通过类芬顿反应催化H₂O₂生成毒性更高的?OH（图2H-I）。

图2、（A）LDH和（B）LDH-DC纳米颗粒的透射电子显微镜（TEM）图像（标尺：100 μm）。（C）LDH-DC、LOX、LDH-DC-LOX、BSA、LDH-DC-BSA的SDS-PAGE蛋白分析。LDH、DC、LDH-DC、LOX、LDH-DC-LOX的（D）紫外光谱和（E）红外光谱。（F）LDH-DC-LOX在不同分散剂中的水合粒径变化。（G）LDH-DC-LOX的乳酸降解能力。（H）LDH-DC-LOX在不同溶液中的电子自旋共振（ESR）图谱。（I）LDH-DC-LOX与亚甲基蓝（MB）溶液反应后的紫外吸收光谱。

团队选用4T1小鼠乳腺癌细胞进行体外实验评价。在一定范围内，随着浓度的增加，LDH的抗癌效果逐渐增强，且在负载DC和LOX之后，显示出更强的抗癌活性（图3A）。其抗癌机制探究显示，LDH-DC-LOX共同递送的DC和LOX能够显著降低细胞内及细胞外的乳酸水平（图3B-C），表明该纳米药物具有良好的乳酸调节能力。掺杂的Cu²⁺能够被肿瘤细胞内的GSH还原以降低GSH水平（图3D）。流式分析显示，LDH-DC-LOX纳米药物处理后，细胞内活性氧（ROS）显著增加，原因可能是DC抑制了乳酸外排出癌细胞，LOX将乳酸转化为H₂O₂，增加的H₂O₂促进类芬顿反应生成?OH。此外Cu²⁺消耗的GSH及Cu⁺的生成进一步增加了?OH的生成（图3E-G）。以上结果表明LDH-DC-LOX具有良好的乳酸代谢和氧化还原代谢双重调节能力。

图3、（A）不同浓度LDH、LDH-DC-BSA、LDH-LOX或LDH-DC-LOX处理4T1细胞24小时的细胞活力（n = 6）。4T1细胞经不同处理12 h（B）细胞内和（C）细胞外的乳酸含量（n = 3）。4T1细胞经不同处理6 h细胞内的（D）GSH含量及（E和F）ROS含量（n = 3）。（G）LDH-DC-LOX改变肿瘤细胞内氧化还原平衡增加ROS含量示意图。图（A-D，F）中，*表示p < 0.05，**表示p < 0.01，***表示p < 0.001。

激光共聚焦显微镜观察显示经LDH-DC-LOX处理后，4T1细胞内的ROS含量明显增加（图4A），且增加的ROS进一步导致细胞内LPO积累（图4B）。流式细胞术结果显示，4T1细胞经不同处理后，与对照组相比，LDH-DC-LOX组展示出最高的凋亡率（图4C）。

图4、4T1细胞经不同处理6 h的（A）ROS含量检测及（B）脂质过氧化物（LPO）含量检测的激光共聚焦图片（标尺：20 μm）。（C）4T1细胞经不同处理24 h凋亡检测的流式细胞术点图（n = 3）。

随后，团队建立小鼠4T1皮下瘤模型进行体内抗肿瘤效果评价（图5A）。在治疗及监测周期内各组小鼠体重无明显降低，表面各组材料注射后均无明显系统毒性（图5B）。通过监测小鼠肿瘤体积变化并称量最终的肿瘤质量发现，LDH-DC-LOX具有良好的肿瘤生长抑制效果（图5C-D）。治疗后小鼠的肿瘤切片染色结果也显示，LDH-DC-LOX组展示出最多的细胞坏死、凋亡及最少的肺部转移病灶（图5E-F），表明LDH-DC-LOX在体内具有良好的抑制肿瘤生长及转移效果。

图5、（A）小鼠4T1肿瘤建立和抗肿瘤实验评价流程示意图。（B）荷瘤小鼠经不同治疗后的（B）相对体重变化（n = 5）、（C）相对肿瘤体积变化（n = 5）、（D）肿瘤体积变化（n = 5）。（E）各实验组小鼠肿瘤切片的H&E及TUNEL染色图片（标尺：50 μm）。（F）各实验组小鼠肺组织切片的H&E染色图片（标尺：1 mm）。图（C-D）中，*表示p < 0.05，**表示p < 0.01，***表示p < 0.001。

团队对LDH-DC-LOX的体内抗肿瘤机制进行了探究。首先是治疗后LDH-DC-LOX对体内免疫系统的激活情况。结果显示，LDH-DC-LOX治疗后，肿瘤中乳酸含量显著降低，肿瘤及脾脏中CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞浸润均显著增加，表明该纳米药物系统在体内具有调节乳酸代谢能力，激活免疫系统，发挥免疫治疗效果（图6A-D）。小鼠血清中的抗肿瘤相关细胞因子水平包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）、颗粒酶B（Granzyme-B）和干扰素γ（IFN-γ）等也明显提升（图6E-G）。荷瘤小鼠经LDH-DC-LOX治疗后免疫系统被激活可能是LDH-DC-LOX治疗后肿瘤中乳酸含量降低导致的。此外，LDH-DC-LOX引起的CDT可能导致的免疫原性死亡也一定程度激活免疫系统。

图6、不同实验组小鼠肿瘤中（A）CD 4⁺ T细胞和（B）CD 8⁺ T细胞的流式细胞术点图。不同实验组小鼠脾脏中（C）CD 4⁺ T细胞和（D）CD 8⁺ T细胞的流式细胞术点图。各实验组小鼠血清中（E）TNF-α、（F）Granzyme-B 和（F）IFN-γ的ELISA检测结果（n = 3）。图（E-G）中， **表示p < 0.01，***表示p < 0.001。

随后，团队探究了LDH-DC-LOX治疗后激活的免疫治疗对CDT的级联增强机制。结果显示，LDH-DC-LOX治疗后，肿瘤中干扰素调节因子1（IRF1）的表达显著增加，胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白（SLC7A11）的表达显著减少，谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）的表达显著降低，GSH含量显著降低（图7A-D）。肿瘤切片的荧光染色结果及定量分析显示LDH-DC-LOX组显示出更高的ROS含量及LPO积累，表明CDT效果被显著增强（图7E-G）。其作用机制是LDH-DC-LOX激活免疫系统，增加的IFN-γ诱导了IRF1上调。IRF1的上调抑制了SLC7A11的表达，从而减少细胞内胱氨酸的摄取并抑制GSH的合成。此外，掺杂的Cu²⁺与GSH反应，同时直接消耗了细胞内的GSH，最终导致细胞内GSH显著降低。GSH水平降低削弱了肿瘤细胞对?OH损伤的防御能力。此外，SLC7A11的下调间接导致GPX4水平的降低。GPX4是一种依赖GSH的酶，通过中和脂质过氧化氢来防止LPO的积累，从而保护细胞。当GPX4表达降低时，LPO水平显著增加，从而使肿瘤细胞对CDT的敏感性增加。

图7、不同实验组小鼠肿瘤中（A） IRF1、（B）SLC7A11、（C）GPX4蛋白表达水平的定量结果图。（D）不同实验组小鼠肿瘤肿GSH含量。不同实验组小鼠肿瘤的（E和F）ROS和（E和G）LPO荧光图像及其定量分析。

综上所述，本研究设计的LDH-DC-LOX纳米药物具有以下显著特点：（1）Cu²⁺、DC、LOX可在酸性TME条件下从纳米平台中释放；（2）DC和LOX的联合作用可有效调节乳酸代谢，减少TME中的乳酸，从而激活免疫治疗，并生成H₂O₂；（3）掺杂的Cu²⁺能够有效调节肿瘤细胞的氧化还原代谢，通过类芬顿反应将H₂O₂转化为更具毒性的?OH，且通过消耗细胞内的GSH增强CDT；（4）LOX催化乳酸产生的H₂O₂和由免疫应答激活后分泌的细胞因子IFN-γ可进一步增强CDT效果。因此，本研究所设计的LDH-DC-LOX纳米药物能够有效地调节乳酸和氧化还原双重代谢途径，通过级联作用激活免疫治疗并增强CDT，为靶向代谢调控治疗肿瘤提供了新的策略。

以上研究成果以“Copper-doped layered double hydroxides co-deliver proteins/drugs for cascaded chemodynamic/immunotherapy via dual regulation of tumor metabolism”为题，在线发表于国际著名期刊Acta Biomaterialia。东华大学生物与医学工程学院沈明武研究员和史向阳教授为共同通讯作者，东华大学博士生李高明为第一作者。该工作得到了国家重点研发计划项目、国家自然科学基金、上海市科委等项目的资助。

文章链接：https://doi.org/10.1016/j.actbio.2025.02.008

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（责任编辑：xu）

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