东华大学洪枫教授团队将大肠杆菌E. coli K-12的甘露糖激酶和磷酸甘露糖异构酶基因引入木葡糖酸醋杆菌（Komagataeibacter xylinus, K. xylinus）ATCC 23770中，构建了强化甘露糖代谢能力的K. xylinus重组菌，并探究了外源基因引入后对菌株发酵过程和细菌纤维素（bacterial cellulose, BC）产品理化性质的影响。相较于原始菌，重组菌能够更有效地利用甘露糖碳源，该技术为今后充分利用咖啡渣、魔芋以及云杉木屑等富含甘露糖/甘露聚糖的生物质资源生产BC开辟了新途径。该成果以A recombinant strain of Komagataeibacter xylinus ATCC 23770 for production of bacterial cellulose from mannose-rich resources为题，发表在欧洲生物技术联合会The European Federation of Biotechnology的官方期刊New Biotechnology（DOI: 10.1016/j.nbt.2023.05.002）。

  细菌纤维素（BC）以其高的纯度、聚合度、结晶度和比表面积，以及良好的生物相容性等优越性能而闻名。基于这些优点，BC在食品、纺织造纸、废水处理、声学和功能材料、生物材料、医疗器械等方面有着广泛的应用前景。然而目前，BC产量和产率低，生产成本高昂，且传统培养基椰子水资源日渐匮乏，因此以其它廉价天然生物质资源为原料生产BC是一必由之路。目前工业界遇到的瓶颈之一是主要生产菌——木葡糖酸醋杆菌K. xylinus对天然生物质培养基中全组分利用的效率低下，因此尚未真正实现大规模工业化生产。

  影响BC生产成本的关键因素之一是发酵工艺。发酵工艺的优化以细菌培养条件为基础，涉及工艺的改进、添加剂的使用和廉价培养基的开发。与其他方式相比，廉价培养基可以显著降低成本。据报道，该课题组前期开发了利用工农业低值产品以及木质纤维素废弃物为培养基原料，譬如魔芋粉（Carbohydrate Polymers，2008，DOI: 10.1016/j.carbpol.2007.09.015）、纸浆工业的云杉木屑/碎片（Microbial Cell Factories，2013，DOI: 10.1186/1475-2859-12-93）、棉纺织品废料（Journal of Chemical Technology & Biotechnology，2016，DOI:10.1002/jctb.4738），已被证明具有作为培养基的潜力。由于生物质培养基所含营养物的复杂性，BC生产菌对多种碳源的代谢能力有限，势必造成资源浪费甚至环境污染。

  木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。以干重计，15-25%的木质纤维素为半纤维素。具体来说，甘露聚糖是针叶木材、豆类和一些工农业副产品（废弃咖啡渣、棕榈仁压饼等）中最丰富的半纤维素。K. xylinus代谢甘露糖关键的限制步骤为磷酸化和异构化，甘露糖被转化为6-磷酸果糖进入代谢通路（图1）。

图1 重组K. xylinus甘露糖代谢图

  针对上述问题，东华大学洪枫教授课题组以生物质资源中丰富的甘露糖为目标，在K. xylinus中强化其代谢途径来更充分地利用复杂的生物质资源，并评估了重组菌用于BC生产的可行性。

图2 重组质粒pBBR1MCS2::pmi::mak

  该研究结果表明，在K. xylinus ATCC 23770中引入外源基因mak和pmi（图2）构建重组菌后，甘露糖的代谢效率显著提高。比较原始株和重组菌株，最明显的差异是重组菌的甘露糖利用率提高了1.6倍，BC产量提高了84%（图3）。在甘露糖培养基中，重组菌株BC的平均纤维直径28.1 nm高于原始菌株的22.7 nm（图4）；原始菌株和重组菌株所产BC的FTIR光谱无明显差异（图5）；重组菌株BC在葡萄糖培养基中的结晶度为61.1%，略低于在甘露糖培养基中的结晶度63.1%（图6）；此外，重组菌株在甘露糖培养基中合成的BC的力学性能也得到了显著改善。拉伸强度和伸长率提高1.7倍，杨氏模量提高1.3倍（图7）。结果表明，mak和pmi的表达使重组菌株对甘露糖具有更好的适应性，生产的BC具有更好的力学性能。

  综上所述，该研究获得了一株具有高效利用甘露糖能力的重组菌株。与原始株相比，甘露糖培养基获得的BC产量和性能都有了显著提高。因此，以廉价的富含甘露糖/甘露聚糖的生物质为原料，开发对应的超强工程菌株是可行的，这一策略对提高BC的生产效率，降低生产成本具有重要意义。该项目是全球首个针对BC生产菌——木葡糖酸醋杆菌拓宽碳源谱的合成生物学研究，具有里程碑意义。

图3原始菌株和重组菌株的pH (A)、溶解氧(B)、残糖(C)、游离细胞数(D)和BC产量(E)

图4 原始菌株和重组菌株生产BC的扫描电镜和纤维直径

图5原始菌株和重组菌株生产BC傅里叶变换红外光谱

图6 原始菌株和重组菌株生产BC的聚合度(左)和XRD测试曲线(右)

 图7 原始菌株和重组菌株生产BC的力学性能

  论文第一作者为东华大学生物与医学工程学院博士研究生杨帆，通讯作者为纤维材料改性国家重点实验室（东华大学）和细菌纳米纤维制造及复合技术科研基地的洪枫教授。该研究得到了山东省科学院齐鲁工业大学生物基材料与绿色造纸国家重点实验室开放基金（KF201920）和海南省重点研发计划项目（ZDYF2021GXJS025）等资助。

  全文下载链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1871678423000225