青岛大学周祺惠/山东省立医院傅强《Carbohyd. Polym.》：负载外泌体的可注射温敏水凝胶用于治疗神经损伤性勃起功能障碍

2022-11-13 来源：高分子科技

盆腔根治性手术是盆腔肿瘤的基本治疗方法，但其术后常伴有因海绵体神经损伤造成的勃起功能障碍（CNI-ED）等并发症，严重影响患者术后生活质量。临床上，ED的治疗方案主要涉及磷酸二酯酶5抑制剂（PDE5is）使用、体内注射疗法（ICIS）和真空勃起装置（VED）介入等，但这些方案对CNI-ED的治疗低效。在该背景下，阴茎假体植入手术成为CNI-ED患者的临床选择。然而，作为一种侵入性治疗策略，阴茎假体植入手术昂贵的治疗费用和存在的机械故障/感染等潜在风险限制了其临床应用的推广。因此，寻找一种新型非侵入的、治疗效果显著的CNI-ED治疗方法具有非常重要的临床价值。

近年来，干细胞及其衍生的外泌体被广泛用于CNI-ED治疗，且已证实间质干细胞（MSC）衍生的外泌体（MSC-Exo）疗法有潜力治愈神经退行性疾病。即便如此，MSC-Exo治疗策略仍存在半衰期短、易被免疫系统快速清除等局限性。鉴于受伤组织修复的复杂过程，如何提高外泌体体内的稳定性和作用持久性成为修复神经损伤的关键问题。

基于此，青岛大学转化医学研究院周祺惠团队和山东省立医院泌尿外科傅强团队基于羟乙基壳聚糖（HECTS）和β-甘油磷酸钠（β-GP）制备了一种新型负载脂肪间充质干细胞（ADSCs）来源外泌体（Exo）的可注射温敏性水凝胶（HG@Exo），并用于CNI-ED疾病的治疗（图1）。结果证实：1）ADSC-Exo显著促进施万细胞（SCs）神经营养因子表达和诱导神经损伤修复；2）温敏性水凝胶HG成功实现ADSC-Exo的局部缓释，并增强其作用持久性；3）HG@Exo成功改善BCNI大鼠的勃起功能障碍。综上所述，HG@Exo对于治疗和预防术中神经损伤引起的ED具有巨大潜力。简要内容如下：

图1. HG@Exo用于治疗CNI-ED示意图。

1.温敏性水凝胶HG制备工艺简单、凝胶化温度/时间适宜

本研究成功分离出ADSC-Exo（图2A-C），并证实温敏性水凝胶HG的制备工艺简单可行（图2D）。FTIR结果证实HG的形成与HECTS分子链N-H基和β-GP分子链O-H基间形成的氢键有关（图2E）。SEM观察到HG内部具有孔径均匀、孔隙连贯的多孔结构（图2F）。流变检测出HG凝胶化温度为28.4℃，凝胶化时间为4分钟（图2G）。此外，本研究还证实HG具有优异的可注射性（图2H），方便临床过程中的微创使用。

图2. （A-B）外泌体形貌和粒径分布；（C）外泌体标志蛋白CD9、CD63和TSG101的表达；（D-F）HG的合成，FTIR光谱和内部形貌；（G）HG在不同温度和时间下的流变力学；（H）HG可注射性。

2.温敏性水凝胶HG可增强ADSC-Exo的局部缓释和作用持久性

本研究将HG@Exo水凝胶应用于BCNI大鼠神经损伤模型（图3A），证实HG@Exo水凝胶组外泌体在大鼠神经损伤部位的保留时间明显长于PBS-Exo组，且能清晰地观察到荧光信号（图3B），表明新型温敏性水凝胶HG可以显著增强ADSC-Exo在损伤部位的缓释和作用持久性。

图3.（A）HG@Exo水凝胶应用于BCNI大鼠神经损伤模型示意图；（B）DiR标记的外泌体体内实时监测。

3.HG可增强外泌体对CNI-ED的治疗作用、提高BCNI大鼠的勃起功能

采用HG@Exo水凝胶治疗模型大鼠的勃起功能，4周后发现假手术组、BCNI组、HG@Exo组、PBS-Exo组和HG组的最大颅内压/平均动脉压比值分别为0.87 ± 0.04、0.39 ± 0.02、0.65 ± 0.05、0.44 ± 0.03、0.52 ± 0.04（图4A-F）。这不仅说明BCNI会导致ED，也证实HG@Exo能显著提高BCNI大鼠的勃起功能。

图4. HG@Exo水凝胶治疗模型大鼠的勃起功能评估：（A-E）ICP曲线。红条表示在60 s内对CN进行电刺激的时间；（F）最大ICP与MAP比率。

为了检测HG@Exo水凝胶治疗CNI-ED有效性的原因，本研究进行了体外细胞实验。考虑到HG@Exo水凝胶换液和室温观察的不便性，本研究直接选择了ADSC-Exo进行体外培养干预。图5A-C是海绵体神经/盆腔神经节（CN/MPG）的解剖结构和体外培养步骤。经治疗后对24、48和72小时的CN/MPG终末突起生长的数目和长度进行测量（图5D），证实ADSC-Exo显著促进了轴突的生长（图5E-F）。经分析ADSCs和ADSC-Exo作用4周后CN/MPG中nNOS的表达情况，也发现ADSC-Exo处理组的nNOS表达明显高于对照组和ADSCs+GW4869组（图5G-H）。

图5. （A）CN/MPG解剖结构和体外培养；（B）CN/MPG解剖图；（C）培养0（i）、24（ii）、48 h（iii）后神经元的生长情况。iv和v是iii的放大图；（D）神经元外植体；（E-F）外泌体和ADSCs促神经元生长情况；（G）CN/MPG中nNOS的表达情况；（H）nNOS与β-肌动蛋白的比例。

4.ADSC-Exo通过促进SCs的存活增强神经损伤的修复

为探讨ADSC-Exo促进神经轴突再生的机制，本研究从SD大鼠坐骨神经中分离出SCs（图6A-B）。结果证实，ADSC-Exo可使EDU阳性率从23.12 ± 1.04%增加到35.76 ± 1.61%（图6C）。对照组H3P掺入量为3.54 ± 0.11%，而ADSC-Exo干预后提升到8.15 ± 0.22%（图6D）。外源性ADSC-Exo也可显著降低SCs的凋亡率（图6E）。基因结果证实，ADSC-Exo可显著促进SCs的神经营养因子表达（图6F-H）。这些结果均表明，ADSC-Exo可通过促进SCs的存活为神经修复提供适宜的微环境，从而促进近端神经纤维末端再生。

图6. （A-B）SCs验证：S100和MBP；（C-D）外泌体干预24h后EdU和H3P的表达；（E）外泌体抑制SCs凋亡情况；（F-H）基因表达情况。

5.HG@Exo改善大鼠CN/MPG的结构和功能

手术治疗4周后，发现HG@Exo组阴茎海绵体平滑肌组织明显增厚、平滑肌与胶原蛋白的比例也显著提高（图7）。分析大鼠nNOS阳性神经纤维含量，可知HG@Exo组大鼠的阴茎背神经中nNOS阳性神经纤维显著高于BCNI组（图8A-B），蛋白表达也显著升高（图8C-D），表明HG@Exo显著改善了BCNI大鼠的海绵组织结构和窦内皮功能。
此外，相比假手术组，BCNI组CN/MPG显示出轴突肿胀、轴突空泡化和低密度神经丝，而HG@Exo组大鼠神经丝染色的密度和规律性得到显著改善（图9），表明HG@Exo显著提高了CN/MPG的结构和功能。

图7.（A）Masson染色；（B）平滑肌含量和胶原蛋白含量比值。

图8.（A）背神经束nNOS表达；（B）nNOS半定量分析；（C）大鼠海绵体中nNOS表达；（D）nNOS与β-肌动蛋白比值。

图9.（A）神经束半定量分析；（B）神经丝平均密度；（C）CN/MPG的Masson染色；（D）胶原蛋白含量。

以上工作以“Injectable thermo-sensitive hydrogel containing ADSC-derived exosomes for the treatment of cavernous nerve injury”为题发表在《Carbohydrate Polymers》期刊上（中科院大类一区，IF：10.723）。本文第一作者为山东省立医院副主任医师刘帅和山东大学硕士研究生李瑞宇，通讯作者为青岛大学转化医学研究院周祺惠特聘教授（课题组网站：https://www.x-mol.com/groups/BMTMers, 课题组微信公众号：生物材料与转化医学课题组）和山东省立医院泌尿外科傅强教授。

该工作得到国家自然科学基金（No. 81602227，81873830，82071653），天津市玻尿酸应用研究企业重点实验室开放基金（No. KTRDHA-Y201902），山东省医药卫生发展计划（No. 202004051394），济南市科技计划（No. 201907037，202134010），国家卫生健康委员会医药卫生发展计划（No. HDSL2020010640），山东省中医药科技项目（No. M-2022209）和济南市新建高校20项目（No. 2021GXRC085）等资助。

原文链接:https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2022.120226

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（责任编辑：xu）

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