烟台大学/潍坊中医药产研院陈大全教授团队 JCR: 仿生活性氧/氮纳米清除剂抑制“铁死亡风暴”调节免疫靶向急性肾损伤

2025-01-10 来源：高分子科技

顺铂（Cis）是治疗各种恶性肿瘤最有效的化疗药物之一，然而其严重的副作用限制了其应用，即使是单剂量的顺铂也能够引起急性肾损伤，这是因为肾脏在顺铂排泄过程中会产生活性氧/氮物质（RONS）损害肾细胞的结构和功能。肾脏排泄受损会进一步加剧毒素积累，使肾脏损伤永久化，并形成威胁癌症患者生命的恶性循环。当顺铂在体内诱导氧化应激损伤时，导致大量 RONS 积累，进而引发严重的炎症反应和细胞凋亡，RONS 的增加强烈促进了脂质过氧化物的积累，从而导致“铁死亡风暴”。到达肾脏的全身给药治疗药物可以迅速清除，从而缩短肾脏暴露时间，这可能不足以达到治疗效果。因此，开发针对肾脏的药物递送系统去除AKI期间过量产生的RON并恢复肾氧化还原稳态对于减少肾损伤、炎症和抑制铁死亡至关重要，从而提高肾脏疾病药物的治疗指数和安全性至关重要。

近日，烟台大学/潍坊中医药产业技术研究院陈大全教授团队基于细胞膜包被的仿生纳米载体的优势，开发了一种用于AKI治疗的多功能仿生纳米递送系统纳米RONS清除剂。Ferrostatin-1（Fer-1）通过4-羧基苯硼酸（4-PBA）和岩藻多糖（Fuc）与姜黄素（Cur）组装，构建ROS响应纳米递送系统（FPPF@Cur），进一步涂覆M2巨噬细胞膜（M2M）形成多功能仿生纳米RONS清除剂（M2FPPF@Cur），设计用于将Cur靶向递送到受伤的肾脏。

相关成果以“Biomimetic Reactive Oxygen/ Nitrogen nanoscavengers inhibit “ferroptosis storm” and modulate immune targeting for acute kidney injury”为题发表在药剂学著名期刊《Journal of Controlled Release》（1区TOP期刊，IF=10.5）上，硕士研究生曹玉昕、刘晓伟为论文的共同第一作者，陈大全教授为论文的通讯作者。相关工作得到了山东省泰山学者计划、山东省自然科学基金重大基础研究等项目的支持。

M2FPPF@Cur治疗急性肾损伤示意图

ROS反应机制促进了AKI部位的药物受控释放，有效清除RONS，减少脂质过氧化，靶向GPX4 蛋白抑制“铁死亡风暴”。通过抑制炎症相关NF-κB/NLRP3信号通路蛋白的表达，调节巨噬细胞从M1表型到M2表型的复极化以调节炎症。M2FPPF@Cur特异性地积聚在受伤的肾脏中，并发挥良好的肾脏保护作用，最终阻止AKI的进展。

图 1.M2FPPF@Cur的制备和表征。(a)FPPF@Cur M2FPPF@Cur的尺寸分布和(b)由DLS确定的zeta电位。(c)FPPF的CMC特性。(d)FPPF@Cur和M2FPPF@Cur的代表性TEM 图像，比例尺 = 100 nm。(e)巨噬细胞、M2M和M2FPPF@Cur中特异性蛋白条带（CD47和整合素α4/β1）的蛋白质印迹分析。(f)72 小时内M2FPPF@Cur粒径和PDI 的变化。(g) M2FPPF@FDA与50μM H₂O₂孵育不同持续时间后的荧光。（h）M2FPPF@Cur的?NO清除能力。(i)和(j)通过 DPPH和ABTS测定测量的M2FPPF@Cur的自由基清除能力。(k)在不同H₂O₂浓度（0 mM、0.5 mM 和 1 mM下 FPPF@Cur的Cur累积释放量。使用单因素方差分析(n = 3)计算统计显著性。P 值： **P < 0.01，***P < 0.001。

使用芘荧光法计算FPPF溶液中的临界胶束浓度为 0.035 mg/mL（图 1c）。动态光散射（DLS）分析显示，FPPF@Cur的平均粒径为183.64±1.7 nm，zeta电位为-17.34±0.5 mV。透射电子显微镜（TEM）显示均匀的球形。M2M涂层后，所得M2FPPF@Cur的流体动力学尺寸从183.64 nm增加到203.87nm，由于 M2M 表面的负zeta电位更强，其zeta电位的负性小于FPPF@Cur。TEM 图像清楚地显示纳米颗粒表面有膜涂层，根据 TEM 图像中的比例尺，测量的 M2 涂层厚度约为15-25 nm。相比之下，DLS 测量的粒径从183.64 nm增加到约203.87 nm，增加了约20.23 nm，这与 TEM 测量的范围非常一致，证实了 M2FPPF@Cur 的成功制备（图1a、b 和 d）。通过 Western blotting分析M2FPPF@Cur上的特异性蛋白质标志物，证明了M2M对FPPF@Cur的有效包被形成M2FPPF@Cur。此外，M2FPPF@Cur的ROS响应和稳定性使M2FPPF@Cur能够靶向 AKI 损伤部位并释放药物以获得治疗效果。通过DPPH 和ABTS测定M2FPPF@Cur的自由基清除能力和总抗氧化能力，证明其具有广谱 RONS 清除特性。

图2.M2FPPF@Cur减少细胞质不稳定的铁并调节GPX4以抑制HK-2细胞中的铁死亡。(a)和(b)用FerroOrange染色的 HK-2 细胞的图像和定量。比例尺 = 100 μm。(c)使用铁检测试剂盒检测 HK-2 细胞中的铁含量。(d)使用GSH检测试剂盒测量 HK-2 细胞中的GSH 水平。(e)和(f)MBB染色的HK-2细胞的图像和定量。比例尺 = 100μm。(g)和(h)HK-2细胞中GPX4的免疫荧光图像和定量。比例尺=100μm。(i)、(j)和(k)Nrf2和GPX4 蛋白表达的蛋白质印迹分析和定量。通过单因素方差分析计算统计显着性(n = 3)。P 值：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。

细胞铁死亡的一个重要原因是铁沉积，铁水平与铁死亡过程中的脂质过氧化高度相关。使用特异性标记不稳定铁的FerroOrange荧光探针和细胞内铁离子检测试剂盒，观察到顺铂处理增加了游离Fe2?的水平。然而，在用Fer-1修饰的M2FPPF@Cur纳米药物系统处理后，Fe2?水平降低。其中，FPPF 治疗可有效降低Fe2?水平，因此，Fer-1作为在纳米载体上修饰的铁死亡抑制剂，用于共同递送药物以抑制铁死亡是必要的（图2a、b和c）。使用单溴双环氧乙烷（MBB）染色和GSH检测试剂盒评估了GSH水平。顺铂治疗导致细胞内 GSH 显着降低，这被M2FPPF@Cur治疗逆转（图2d、e和f）。GPX4 是去除脂质过氧化物的关键蛋白，是铁死亡的关键调节因子。顺铂显着下调GPX4 活性，促进铁死亡，而M2FPPF@Cur处理将GPX4 活性恢复到接近正常的水平，从而抵消铁死亡（图 4g和h）。Nrf2也是铁死亡的关键调节因子，Western blot分析显示，M2FPPF@Cur恢复了 GPX4 蛋白表达并显着激活了Nrf2表达，从而调节铁死亡（图2i、j和k）。这些结果表明，M2FPPF@Cur 通过减轻铁死亡来有效防止 Cis 诱导的 HK-2 细胞损伤。

图3.M2FPPF@Cur 在体外调节巨噬细胞极化和 NF-κB 通路。(a)和(b)活化的巨噬细胞诱导的巨噬细胞迁移的代表性图像和定量分析。比例尺 = 100 μm。(c)和(d)与各种处理共培养的 RAW264.7 细胞中 CD86 和 CD206 的免疫荧光染色。比例尺 = 100 μm。(e)细胞上清液中的 TNF-α 水平(f)细胞上清液中的 IL-10 水平。(G-J)对 Cur、FPPF@Cur 和 M2FPPF@Cur 处理的 LPS 活化的 RAW264.7 细胞中的 IκB、p65、p-IκB 和 p-p65 蛋白进行蛋白质印迹分析。通过单因素方差分析计算统计显着性 (n = 3)。P 值：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。

巨噬细胞在炎症性疾病中起着至关重要的作用，这些细胞的浸润是急性肾损伤（AKI）的一个突出特征。已知活化巨噬细胞的积累会加剧组织炎症。因此评估了M2FPPF@Cur减少活化巨噬细胞募集和减轻组织炎症的潜力。LPS刺激的巨噬细胞释放化学引诱剂，诱导趋化性并导致巨噬细胞从上侧向下侧大量募集。然而，M2FPPF@Cur显著减少了活化巨噬细胞的迁移，表明其能够抑制巨噬细胞募集和减少炎症（图3a和b）。因此，M2FPPF@Cur通过阻断LPS诱导的巨噬细胞迁移表现出抗炎特性。M2FPPF@Cur的清除能力可能促进巨噬细胞向M2 表型极化并减少M1巨噬细胞极化。CD86和CD206分别是M1和M2巨噬细胞的表面标志物。用M2FPPF@Cur处理巨噬细胞显着降低CD86表达，同时增加 CD206表达（图3c和d）。细胞培养上清液的ELISA分析表明，M2FPPF@Cur有效抑制了促炎因子TNF-α的分泌，并上调了抗炎因子IL-10的分泌（图3e、f）。因此，这些体外实验证实M2FPPF@Cur抑制巨噬细胞向M1表型的极化并促进向M2表型的极化，显示出显着的抗炎作用。通过Western blot分析检查了不同处理对NF-κB通路中IκB、p-IκB和p65、p-p65水平的影响，M2FPPF@Cur组p-IκB和p-p65蛋白减少，而IκB和p65的总表达保持不变（图3g-j）。表明M2FPPF@Cur抑制NF-κB通路并减缓炎症性疾病的进展。

图4.M2FPPF@Cur抑制NLRP3炎性小体激活(a)NLRP3和Caspase-1p20的免疫染色图像。比例尺= 100 μm。(b)、(c)和(d)NLRP3和 Caspase-1p20的蛋白质印迹分析和定量。(e)RAW264.7 细胞中IL-1β和IL-18的免疫荧光图像。比例尺= 100μm。(f)细胞上清液中的IL-1β水平。(g)细胞上清液中的IL-18 水平。使用单因素方差分析(n=3)计算统计显着性。P 值：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。

在炎症反应期间，NLRP3炎性小体被激活。在肾脏中，巨噬细胞包含NLRP3炎性小体的完整成分，包括NLRP3、ASC和pro-caspase-1。NLRP3炎性小体的激活触发caspase-1的激活，导致成熟的促炎细胞因子IL-1β和IL-18 的释放。这个过程会诱发细胞焦亡，从而导致肾脏炎症、细胞死亡和肾功能受损。免疫染色和 Western blot 分析显示，LPS刺激显着激活NLRP3炎性小体，表达水平增加证明了这一点。用 M2FPPF@Cur处理几乎消除了NLRP3在细胞质中的积累。NLRP3炎性小体的组装使caspase-1被蛋白水解裂解成活性 caspase-1p20，然后使炎性细胞因子IL-1β和IL-18从其前体pro-IL-1β和pro-IL-18中成熟。免疫染色和Western blot 分析表明，M2FPPF@Cur抑制caspase-1向活性caspase-1p20 的转化（图4a-d）。此外，细胞上清液的 ELISA分析表明，IL-1β和 IL-18 在LPS诱导后显着表达，但在M2FPPF@Cur 处理后它们的水平显着降低（图4f，g）。IL-1β和IL-18的免疫荧光染色证实了这些发现（图4e）。

图5.M2FPPF@Cur的体内生物分布和治疗效果。(a)AKI模型中的M2FPPF @ Cur生物分布(b)显示肾切片的代表性H&E染色。比例尺= 100μm。(c)显示用 TUNEL（绿色）和DAPI（蓝色）染色的代表性肾切片的共聚焦图像。比例尺= 100μm。(d)显示用DHA（红色）和DAPI（蓝色）染色的代表性肾切片的共聚焦图像。比例尺= 100μm。(e)显示小鼠肾组织中Kim-1的免疫组织化学染色。比例尺= 50μm。(f)、(g)和(h)目前对小鼠肾组织中Bax、Bcl-2和Kim-1进行蛋白质印迹分析。(i)指示小鼠血清中的Kim-1水平。(j)显示小鼠血清中的BUN水平。(k)显示小鼠血清中的Scr水平。使用单因素方差分析（n = 3）计算统计显著性。P 值：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。

治疗药物在肾脏中的靶向积累是成功治疗的先决条件，由于M2M封装，M2FPPF@Dir能够更有效地靶向AKI中发炎的肾脏区域。通过HE染色检查了其对顺铂诱导的AKI肾组织病理的影响。AKI组表现为严重的肾组织损伤，伴有广泛的肾小管上皮变性。M2FPPF@Cur干预后，肾组织损伤得到改善。进一步探索了M2FPPF@Cur在体内的抗氧化能力。M2FPPF@Cur抑制了AKI小鼠肾脏中ROS的产生，表明它可能具有对抗肾脏氧化损伤的抗氧化潜力（图5d）。为了评估 M2FPPF@Cur 对肾损伤的影响，通过免疫组化、ELISA 和蛋白质印迹评估了Kim-1 在肾组织中的沉积，结果表明M2FPPF@Cur 可有效抑制细胞凋亡并保护肾组织免受损伤。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2025.01.006

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