益生菌和病原体的鉴别对人体健康有着非常重要的意义，具有高度特异性（包括菌株特异性）的微生物靶向疗法因而也获得了很大的关注。
苏州大学陈高健教授、陈红教授以及英国华威大学 David M. Haddleton 教授等同合作者们利用大肠杆菌 MG1655 菌株作为活性模板，原位合成了一种具有高度选择性的含糖聚合物。通过这种细菌-糖单体-适配聚合 (BS-MAP) 的方法，研究人员们在细菌表面上得到了可以识别两种不同大肠杆菌菌株的含糖聚合物，并通过细菌聚集实验和 QCM-D 测量证实了这种含糖聚合物的特异性细菌结合能力。此外，这种含糖聚合物还表现出较强的抑菌能力，还可以防止细菌在共培养试验中伤害正常细胞。
相关工作以前沿论文 (Edge article) 发表在英国皇家化学会旗舰期刊 Chemical Science 上并入选 2019 Chemical Science HOT Article Collection。
研究背景
益生菌可保护宿主免受外界环境的侵害，而致病菌可能会引起传染病。抗生素通过杀灭病原体来治疗细菌感染，但它们也可能杀灭非病原体，从而改变微生物群的组成并增加对继发感染的易感性。另外，细菌菌株与细菌种类一样重要，因为微小的突变可能将益生菌转化为相同种类的致病菌，一些非致命微生物甚至可能因此变得致命。因此，开发微生物靶向性的抗菌疗法就变得至关重要；这种药剂应具有高度的特异性，包括对菌株的特异性。
菌株 (strain) 也称品系，是指同种细菌中不同来源的纯培养物。具有典型特征的菌株称为典型株或代表株或标准株。不同菌株可能性状完全相同，也可能有某种微小差异。
在不同的选择性试剂中，糖类在涉及信号识别和信号传导的生物过程中起着重要的作用。一些糖对蛋白质具有高亲和力，使其在特异性方面展现出巨大优势，因此人工合成的含糖聚合物能表现出很强的选择性。然而，如何获得在菌株水平上识别特定细菌的含糖聚合物仍需探索，而这样的工作还尚未有报道。
本篇论文
本文作者选择了合适的糖单体和聚合方法，以细菌为「活」模板，通过糖序列的优化排列，原位合成了能实现菌株特异性亲和的含糖聚合物。这种方法被称为细菌-糖单体-适配聚合法 (bacteria-sugar monomer-aptation-polymerization, BS-MAP)。
鉴于大肠杆菌的基因型多样性和操作便捷性，本文作者选择大肠杆菌为模型细菌。所用的两种单体是 MAG 和 MEDSA。
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MAG 是具有细菌结合能力的含糖单体；
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MEDSA 是不含糖的非结合单体，可以作为聚合物链中的间隔分子。
得益于大肠杆菌的还原性，这些单体以再生电子转移催化 (activator regenerated electron transfer, ARGET) 机制进行原子转移自由基聚合 (atom transfer radical polymerization, ATRP)，得到两种聚合物：
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直接从溶液中获得的聚合物（SP，可理解为 solution polymer)；
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向体系中加入甘露糖 (mannose) 后从细菌表面上洗脱获得的聚合物（BP，可理解为 bacteria polymer）。
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细菌存在下的聚合过程示意图，可以获得两种不同的聚合物 SP 和 BP。 |
本文作者还在没有模版细菌存在的情况下进行自由基聚合，制备出了非模板化的聚合物 (non-templated polymer, NP)，以便与 SP 和 BP 进行对比。SP 和 NP 中的糖含量都约为 30%，BP 中的糖含量则高达约 50%。此外，本文作者还根据 BP 中的 MAG 和 MEDSA 含量，制备得到了和 BP 具有相同单体组成比例的聚合物 RP（可理解为「随机聚合」Random Polymerization）。
细菌聚集试验和 QCM-D 测试证明了 BP 聚合物对细菌菌株的特异性，并且产生特异性的主要因素不是含糖聚合物中的糖含量以及 MAG 和 MEDSA 的比例，而是链的序列。通过 BS-MAP 可以方便地获得具有优化的糖含量和链序列的含糖聚合物。共培养试验表明 BP 聚合物是细菌粘附的潜在抑制剂，也是内皮细胞在金底物上附着和增殖的促进剂。
该方法为人工合成的含糖聚合物的制备提供了一种方便和通用的策略，所报道的含糖聚合物对用作合成模板的细菌具有高度的特异性。该技术有望成为许多应用的基础，例如细胞和微生物的标记和捕获等。本文入选 2019 Chemical Science HOT Article Collection。苏州大学博士研究生罗妍为本论文的第一作者，David M. Haddleton 教授、陈高健教授、陈红教授为本论文的共同通讯作者。
图文解读
本文作者首先使用细菌聚集实验来研究 BP 是否可以按预期与模板细菌进行特异性的结合。除上述三种共聚物外，还合成 MAG 和 MEDSA 的均聚物 pMAG 和 pMEDSA 作为对照。为了测试聚合物的特异性，选择了大肠杆菌菌株 DH5α (E. coli DH5α) 作为非模板细菌，其衍生自模板菌株大肠杆菌菌株 MG1655 (E. coli MG1655)，只是基因组略有改变（属于不同的菌株）。
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图 1. (A) 聚合物 NP、SP、RP、BP 引起的模板菌株 E. coli MG1655 和非模板菌株 E. coli DH5α 的聚集，两种菌株均用 STYO9（绿色）染色。 如 (A) 所示，在各聚合物中，以 E. coli MG1655 为模板得到的 BP 聚集 MG1655 的能力最强。pMEDSA 引起的 MG1655 聚集非常少，可能是由于其作为两性离子可抑制细菌的靠拢；pMAG 引起 MG1655 的部分聚集，但程度远低于 BP，表明较高的糖含量未必会获得更高的亲和力。NP 和 SP 引起少量的 MG1655 聚集，但程度小于 BP 和均聚物 pMAG。除了 BP 外，其它聚合物聚集非模板菌株 DH5α 的能力与它们对模板菌株 MG1655 的聚集能力类似。与 MG 1655 在 BP 溶液中的情况相比，BP 溶液中 DH5α 聚集簇的数量显著减少，甚至低于 NP 中的结果。 |
上述结果表明，从模板菌株 E. coli MG1655 表面获得的 BP 聚合物具有菌株特异性的亲和力。对于涉及到复杂体系的「真实世界」，希望 BP 可以在两种或更多种细菌组成的菌群中特异性地识别靶标。因此，本文作者接下来测试的是 BP 在由模版菌和非模版菌组成的混合物中识别模版菌的能力。
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图 1. (B) 聚合物 NP、SP、RP、BP 引起的模板菌和非模板菌混合物中的分离和聚集状态；模板菌株用 STYO9（绿色）染色，非模板菌株用表达红色荧光蛋白的靶基因修饰。 如 (B) 所示，在 NP 和 SP 的溶液中出现了一些细菌的聚集，红色和绿色的荧光都有被观察到，表明这两种聚合物与细菌的结合较弱，且是非特异性的。RP 的情况下两种细菌都只有部分聚集。对照明显的是，在 BP 溶液中，观察到大的绿色簇但未观察到红色簇，进一步证实 BP 在模版菌与非模板细菌的混合物中具有对模板菌株 MG1655 具有特异性的亲和力。 |
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图 2. (A) 共聚物 RP、NP、SP、BP 的 13C-NMR 表征，核磁碳谱峰的典型差异。 如图所示，在 –CH?– 碳的化学位移区域 (58 – 61 ppm)，所有的其它共聚物都在 60.5 至 60.8 ppm 附近显示出两个宽峰，而只有共聚物 BP 显示出两个尖峰，它们被确定为 MAG 和 MEDSA 单体 –CH?–O– 上两处化学环境不同的碳。 |
上述结果表明上述含糖聚合物的链序列不同，这也解释了它们的特异性与结合能力差异。受限于现有的分析方法，BP精确的单体序列目前还无法确定。
接下来，本文作者还通过耗散型石英晶体微天平 (Quartz Crystal Microbalance with Dissipation, QCM-D) 测量和金纳米颗粒 (gold nano-particles, GNPs) 对含糖聚合物进行进一步的细菌结合能力评价。其中，QCM-D 是基于石英的压电特性制备的一种表面敏感型分析技术，能感应到纳克级的质量变化，可以用于微生物吸附行为的研究。
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图 S14. 细菌层分别与聚合物 NP、SP、BP 溶液接触情况下，QCM-D 频率随时间的变化：(A) 模板菌株 E. coli MG1655 和 (B) 非模板菌株 E. coli DH5α。(C) 为与聚合物 NP、SP、BP 溶液接触后模版菌与非模板细菌层 QCM-D 频率变化平均值。 如 (A) 所示，BP 对模板菌株 E. coli MG1655 的吸附是各聚合物中最高的，与细菌聚集实验的结果一致。如 (B) 所示，在非模板细菌株 DH5α 中，由 NP 和 SP 引起的频率变化与模板菌类似。然而，DH5α 对 BP 相对于 MG1655对BP 有着显著的差异：首先是频率快速降低，注入水后频率又迅速增加，表明 BP 与非模板菌之间的相互作用很弱（被水轻易洗脱）。(C) 中给出的比较结果表明，BP 对模板菌的频率变化大约是非模板菌的 47 倍，BP 对模板菌的特异性非常明显。 |
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图 3. (A) 用含糖聚合物 SP 和 BP 修饰金纳米颗粒 (gold nano-particles, GNPs) 的过程示意图。(B) 修饰后的 GNPs 和模板菌 MG1655 之间的相互作用。 如图所示，SP 修饰的 GNP 在细菌周围随机分布，只有少数粘附到细菌上。相反，BP 修饰的 GNP 则大量出现在细菌表面附近，表明了 BP 和 MG1655 之间的特异性亲和力。 |
在上述实验数据成功地展示出 BP 特异性结合模版菌的特性后，本文作者接下来对 BP 作为抗感染剂的可能性进行了初步研究。作者推测 BP 会占据特定细菌的结合位点，从而阻止或削弱细菌与细胞的相互作用。本文所进行的试验以内皮细胞 (endothelial cells, ECs) 为模型：纺锤形细胞形态表明细胞功能较为健康，圆形细胞形态表明细胞活性较低。
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图 4. 含糖聚合物 BP、SP、NP 在抗感染实验中的抑菌作用。(A) 与细菌和不同聚合物孵育 12 小时后 ECs 的图像：(1) 不含聚合物／空白；(2) 加入 BP；(3) 加入 SP；(4) 加入 NP。(B) 暴露于不同聚合物后，纺锤形 ECs 的百分比。 如图所示，在暴露于细菌后，依然保持活性的 EC 细胞不到 20%。SP 和 NP 的引入改善了细胞活性率至约 50％，而在引入 BP 时几乎所有细胞都呈活性较好的纺锤形。可见这些含糖聚合物可以抑制 MG1655 菌对正常细胞的伤害，而对 MG1655 具有最高亲和力的 BP 正是最有效的抗菌剂。 |
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图 5. BP 在金表面共培养实验中的抑制作用 (C + B: cells + bacteria)。EC 细胞核用 DAPI（蓝色）染色，F-肌动蛋白用 FITC（绿色）染色。(A) 金表面上不存在（C + B，左侧）与存在（C + B + BP，右侧）含糖聚合物 BP 的情况。(B) C + B 和 C + B + BP 情况下金表面上的 ECs密度。 如图 (A) 所示，ECs 未能有效地与 MG1655 竞争，金表面几乎未观察到细胞，仅有的少数绿点可能是细胞的残片。该结果表明 MG1655 细菌抑制了 EC 细胞的生长，甚至导致其死亡。当存在 BP 时，可见 EC 细胞呈纺锤形，看起来更为健康。由 (B) 可知，BP 组中的细胞密度比无 BP组高 8 倍，表明 BP 在金表面存在细菌的情况下可以促进 EC 的粘附和铺展。 |
本文作者最后指出，虽然 BP 未必能完全阻止细菌的定植或完全消除细菌对正常细胞的负面影响，但通过引入杀菌基团（如 Ag? 或季铵基团）等方法有望大大提高其抗菌性能。
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