当前全球老龄化形势严峻，老年患者骨再生能力不足。一方面，衰老骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化能力显著下降，线粒体功能障碍导致能量代谢异常。另一方面，衰老相关分泌表型（SASP）产生促炎因子和活性氧（ROS），抑制成骨和血管生成。现有疗法存在局限，单纯清除衰老细胞和抑制SASP未能同时解决BMSCs与微环境间的复杂交互作用。

  针对以上难题，苏州大学附属第一医院朱雪松/张一健/蒋定华团队和华东理工大学袁媛团队联合开发了一种过表达NAD依赖性去乙酰化酶Sirtuin 3（SIRT3）的聚癸二酸甘油-共聚乙二醇/聚丙烯酸（PEGS /PAA）水凝胶，并用于治疗老年性骨缺损。此基因工程水凝胶的主要创新点在于：1. 通过缓解BMSCs的衰老损伤并清除SASPs，显著促进成骨分化；2. 通过螯合周围铁离子，构建了局部促骨生成的低氧微环境；3. 通过调控巨噬细胞极化相关的免疫信号通路，加速老年骨组织修复。

  该工作以"An "inside-out"-guided genetically engineered hydrogel for augmenting aged bone regeneration" 为题发表于《Bioactive Materials》杂志。

图1. 基于“内外兼修”理念设计基因工程水凝胶并用于治疗老年性骨损伤示意图。过表达SIRT3的PEGS /PAA@SIRT3水凝胶的制备流程。在细胞内，SIRT3过表达增强成骨能力，减轻BMSCs的衰老损伤（胞内作用）。在细胞外，PEGS /PAA中的羧基螯合铁离子以模拟缺氧条件并促进HIF-1α表达（胞外效应）。这些联合机制延缓细胞衰老，促进骨愈合。

  通过构建成年（6月龄）和老龄（18月龄）大鼠临界颅骨缺损模型，评估骨缺损修复能力差异。使用单细胞数据分析衰老环境对骨组织细胞亚群的改变，并筛选出SIRT3在衰老进程中发挥重要作用。成年大鼠在骨组织损伤后的再生情况表现出良好的愈后，而随着年龄的增加，老龄大鼠的细胞表现出衰老表型P21、P16蛋白的组织内阳性率明显增多，严重影响了骨组织的整合再生能力，表现为骨缺损的不愈合。单细胞测序的结果显示，单细胞测序显示祖细胞及成骨细胞群体丰度减少，细胞周期G2/M期阻滞，其特征是G2M其的增多和对低氧刺激的高敏感性。此外，衰老的骨微环境损害了胶原形成和细胞外基质的合成，SIRT3高表达的成骨细胞以及BMSCs丰度显著下降，表明SIRT3在协调骨形成中的重要调节作用（图2）。

图2. 通过体内荧光染色和单细胞数据分析筛选出调控衰老进程的关键靶点SIRT3。

  作者通过巯基-迈克尔加成反应合成PEGS/PAA互穿网络水凝胶，并负载包裹AAV-SIRT3的介孔二氧化硅纳米颗粒。FTIR、XPS、SEM、EDS等结果均证实了水凝胶的成功制备，同时具有丰富的孔隙结构，体外释放实验也验证了水凝胶的封装使得纳米颗粒实现了持续28天以上的缓释效应。相比单纯PEGS水凝胶，PEGS/PAA@SIRT3水凝胶更好的实现了水凝胶在体外的降解和药物缓释功能，较好的解决了基因修饰纳米颗粒快速降解、效能不稳定的问题。这无疑模拟了更好的骨组织微环境，同时也为损伤细胞提供了基因编辑的平台（图3）。

图3. PEGS/PAA@SIRT3水凝胶的制备与表征。

  作者后续使用体外水凝胶与衰老细胞进行共培养。细胞周期实验、PCR、WB等实验，共同验证了PEGS/PAA@SIRT3水凝胶能够有效恢复正常细胞周期，减少衰老相关分泌表型，β-半乳糖苷酶染色、细胞免疫荧光染色也得到相同结论（图4）。

图4. PEGS/PAA@SIRT3水凝胶的对衰老进程的延缓作用。

  此外，PCR、WB、碱性磷酸酶染色、茜素红染色等实验结果表明PEGS/PAA@SIRT3水凝胶体系在衰老细胞中能够显著加速成骨分化，上调成骨相关标志物，促进钙结节沉积，有效抵御衰老导致的成骨能力下降（图5）。

图5. PEGS/PAA@SIRT3水凝胶的对成骨分化的促进作用。

  RNA-seq富集分析的结果显示PEGS/PAA@SIRT3水凝胶导致多个骨免疫相关通路和因子出现差异性表达，研究者们使用流式细胞术、细胞免疫荧光等方法探究了PEGS/PAA@SIRT3水凝胶对巨噬细胞极化的潜在影响，结果表明，PEGS/PAA@SIRT3显著促进巨噬细胞M2型极化，抑制M1型极化，构建了促成骨分化的免疫微环境（图6）。

图6. PEGS/PAA@SIRT3水凝胶对骨免疫的调控作用。

  作者后续构建老龄大鼠的临界骨缺损模型，并以此验证PEGS/PAA@SIRT3水凝胶的体内疗效。Micro-CT重建分析显示PEGS/PAA@SIRT3组骨再生进程显著加快。术后8周，PEGS/PAA@SIRT3组标本的骨连续性成功恢复，伴随着故体积分数、骨密度、骨小梁厚度、骨小梁数量的显著上升（图7）。

图7. PEGS/PAA@SIRT3水凝胶对老龄大鼠骨缺损的治疗作用。

  为了进一步证明SIRT3在骨愈合过程中的作用，研究者在SIRT3敲除小鼠体内构建颅骨临界骨缺损模型，并以此揭示PEGS/PAA@SIRT3水凝胶的优越性。Micro-CT重建分析显示PEGS/PAA@SIRT3组骨再生进程显著加快。免疫组化结果证明，该水凝胶在敲除SIRT3的条件下仍旧能够补充SIRT3的含量，在骨组织中抑制衰老标志物P16的表达，并促进骨钙素（OCN）的增加（图8）。

图8. PEGS/PAA@SIRT3水凝胶有效促进SIRT3敲除小鼠的骨缺损修复。

  总而言之，PEGS/PAA@SIRT3水凝胶通过靶向递送SIRT3、模拟缺氧微环境及调节免疫稳态，有效逆转老年骨缺损区的衰老微环境，为临床治疗衰老相关性骨疾病提供创新性解决方案。

  原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X25001896?via%3Dihub