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西安交大郭保林团队 AFM:具有可控NO释放的纳米酶基多重刺激响应晶胶自适应伤口敷料用于感染伤口愈合
2023-08-11  来源:高分子科技

  由于日常生活和战场紧急情况下皮肤破损的普遍存在,特别是细菌等其他病原体会引起伤口感染,从而增加患者死亡的风险。细菌感染的传统治疗方法是抗生素治疗,但滥用抗生素导致耐药性灾难仍然是不可忽视的危机。因此,必须为这些感染伤口的传统治疗方法提供一种有前途的替代途径。迄今为止,感染伤口愈合的治疗主要集中在消除感染阶段的细菌定植,而感染伤口愈合后期的需要常常被忽视。因此,目前仍缺乏适应感染伤口愈合不同阶段需求的自适应伤口敷料。自适应伤口敷料可以选择性地针对伤口愈合的微环境变化发挥治疗作用,这将极大地避免对正常组织的损伤,并为新组织的重建提供积极的治疗。有趣的是,自适应伤口敷料往往具有刺激响应性的特点,能够对伤口微环境(如温度、pH、湿度等)的变化做出“智能”反应。正常情况下,健康皮肤的pH值呈弱酸性,不利于细菌生长。急性伤口形成后,内部组织液使皮肤的pH值升高至接近7.4,这为细菌感染提供了有利的环境。在感染过程中,细菌产生乳酸等多种酸性代谢产物,导致伤口环境的pH值降低。


  纳米酶可以模仿天然酶的催化行为,表现出大量的催化活性表面原子,可以实现高活性的催化效果。纳米酶可以响应伤口愈合各个阶段的微环境变化而发挥不同的类酶催化活性。另一方面,气体疗法因其对细胞的快速渗透性和改善微循环的能力而成为最有前途的伤口愈合手段之一,一氧化氮(NO)在抑制细菌感染、消除生物膜方面表现出独特的优势。具体来说,NO可以与ROS反应生成过氧亚硝酸盐(ONOO?),当其浓度为10-6-10?9 M时,可以完全根除细菌形成的生物膜。为此,他们构建了天然NO供体精氨酸修饰的二硫化钼基纳米酶(MSPA),并将其负载在具有pH响应和光热响应的甲基丙烯酰羧甲基壳聚糖-聚(N-异丙基丙烯酰胺)冷冻凝胶内。通过控制近红外光的照射时间,纳米酶通过基于电子的带隙跳跃光催化反应产生ROS并催化精氨酸可控产生NO,实现光热/光动力/气体协同抗菌治疗。在伤口感染消除后,冷冻凝胶通过纳米酶的自适应特性在慢性伤口愈合的偏中性微环境发挥类超氧化物歧化酶(SOD)和类过氧化氢酶(CAT)样活性,催化超氧自由基以及内源性和外源性过氧化氢转化为水和氧气,缓解慢性伤口过度氧化应激。此外,基于纳米酶的多重刺激响应冷冻凝胶还具有伤口渗出液管理能力以及良好的止血特性,这拓宽了其应用潜力。


  鉴于此,他们基于甲基丙烯酰基羧甲基壳聚糖、聚(N-异丙基丙烯酰胺)和复合纳米酶(MSPA)制备了一系列具有可控NO释放能力的多重刺激响应冷冻凝胶用于耐药菌感染创面的自适应治疗。相关研究以“Multiple Stimuli‐Responsive Nanozyme‐Based Cryogels with Controlled NO Release as Self‐Adaptive Wound Dressing for Infected Wound Healing”为题发表在《Advanced Functional Materials》。西安交通大学前沿科学技术研究院博士研究生杨雨桐和李勐博士为该论文的第一作者,郭保林教授为通讯作者。


一、冷冻凝胶的制备


  选择甲基丙烯酰缩水甘油酯(GMA)对羧甲基壳聚糖(CMCS)改性,合成了双键修饰的羧甲基壳聚糖。随后采用冰晶模板技术将双键修饰的羧甲基壳聚糖(CMCSG)和热敏性聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)共聚,在低温下形成具有大孔结构的CMCSG/PNIPAM冷冻凝胶。同时,将精氨酸修饰的二硫化钼基纳米酶(MSPA)掺入CMCSG/PNIPAM冷冻凝胶中,形成CMCSG/PNIPAM/MSPA(简称C/N/MPA)冷冻凝胶作为自适应纳米酶和NO级联释放载体,并通过调控MSPA的浓度制备了一系列冷冻凝胶。 


图1. 纳米酶基冷冻凝胶的制备及自适应治疗机制


二、光热/光动力特性及NO释放能力


  纳米酶的负载使冷冻凝胶具有优异的光热转换能力和良好的光热稳定性。此外,利用不同的ROS探针分别验证了体外冷冻凝胶产生单线态氧、超氧自由基和羟基自由基的产生。谷胱甘肽(GSH)是在细菌抗氧化防御系统中发挥重要作用的三肽。他们评估了冷冻凝胶在近红外光照射下的GSH清除特性。GSH的损失随着MSPA浓度的增加而显着增加。其中,C/N/MPA20的GSH损失最高(约44.2%)。与阴性对照组相比,C/N/MPA10和C/N/MPA20处理后的GSH颜色几乎变成无色,这表明GSH发生了较高程度的氧化。精氨酸作为天然的内源性NO供体,在iNOS、NADPH和ROS的作用下,通过生化或催化反应生成NO。用Griess试剂对C/N/MPA的NO产生进行了表征。经过近红外照射10分钟后,C/N/MPA10的累积NO产量达到5.23 μM。还通过间歇性近红外辐射证明了NO释放的可控性和重现性,交替的照射结果表明NO的释放以触发的形式发生。 


图2. 冷冻凝胶的光热/光动力/NO释放能力


三、细菌捕获及体外抗菌能力


  细菌表面带有大量的负电荷,其表面电位通常比哺乳动物细胞更低。受益于羧甲基壳聚糖的自适应可调质子化效应,为冷冻凝胶的细菌捕获提供了可能性。评估了冷冻凝胶在不同pH条件下捕获细菌的能力。随着pH值从7.4降低到3,C/N/MPA10对大肠杆菌(E.coli)的捕获率从21%增加到38%,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的捕获率从12%增加到27%。这些结果归因于冷冻凝胶响应环境pH值变化而形成的自适应细菌捕获能力。 


图3.细菌捕获、体外抗菌以及体外生物膜清除


  随后评估了对大肠杆菌和MRSA的体外抗菌能力。近红外照射3分钟后,E.coli和MRSA的抑制率分别达到98.4% 和98.5%。近红外照射5分钟后,对两种细菌的抑制率几乎达到100%。采用结晶紫染色来评估C/N/MPA对MRSA生物膜的抑制作用。近红外照射10分钟后,C/N/MPA5和C/N/MPA10的残留生物膜分别减少至30%和14%。


四、体内生物膜清除


  建立体内生物膜模型进一步验证了冷冻凝胶消除体内生物膜的能力。MRSA感染24小时后,伤口形成明显的生物膜,表明体内生物膜成功建立。与空白组相比,冷冻凝胶显着抑制细菌形成的生物膜,C/N/MPA0和C/N/MPA10对生物膜的抑制率为25.7%和34.3%,这归因于CMCS固有的抗菌作用。C/N/MPA10+NIR组对生物膜的抑制率达到约98%。使用吉姆萨染色来评估伤口部位的残留细菌。空白组伤口处形成明显密集的菌落,且分布较大表明伤口已形成严重感染。C/N/MPA0和C/N/MPA10菌落分布面积略小于空白组。对于C/N/MPA10+NIR,伤口部位几乎没有明显的细菌定植。这些结果证实体内生物膜被有效清除。 


图4.体内生物膜清除能力


五、MRSA感染小鼠皮肤创面修复


  C/N/MPA10+NIR组5天后伤口闭合率最显着,为50.5±4.1%。相比之下,TegadermTM薄膜组、C/N/MPA0组和C/N/MPA10组的伤口闭合率分别为31±1.7%、39.8±2.6%和40.1±3.5%。治疗15天后,C/N/MPA10+NIR组的创面几乎完全被新皮肤覆盖。相比之下,TegadermTM薄膜组仍有13.7±1.9%的剩余伤口面积。 


图5.小鼠体内感染创面的修复


  总而言之,他们制备了一系列用于感染创面治疗的具有可控NO释放的多重刺激响应纳米酶基冷冻凝胶。C/N/MPA10冷冻凝胶在经过近红外的辅助治疗下显示出高效的抗菌效果,并通过多重纳米酶活性缓解伤口氧化应激,加速伤口愈合,显示出比商品敷料TegadermTM更好的伤口收缩和胶原蛋白沉积能力,在感染伤口的自适应治疗方面显示出巨大潜力。


  原文链接:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202214089


  作者简介:郭保林,博士,西安交通大学教授,博士生导师,国家级青年人才计划入选者,陕西省杰出青年基金获得者,爱思唯尔中国高被引学者。2011年从瑞典皇家理工学院(KTH)获得高分子材料学博士学位,师从瑞典皇家工程院院士Ann-Christine Albertsson教授。主要从事生物医用高分子材料的研究,具体研究方向包括可降解导电高分子材料、多功能水凝胶、组织工程支架与再生医学、药物控制释放体系、皮肤敷料、止血材料、可穿戴器件等。已经以第一/通讯作者在Nature Reviews Chemistry, Nature Protocols, National Science Review, Nature Communications, Advanced Functional Materials, ACS Nano, Biomaterials等国际期刊发表论文120余篇,ESI高被引论文30余篇, 单篇最高引用1200余次,SCI引用19000余次,H指数70。授权/申请发明专利12项,目前主持省部级科研项目10项,包括国家自然科学基金委项目4项。获陕西省高等学校科学研究优秀成果奖一等奖(第一完成人)和美国化学会Chemsitry of Materials Lectureship Award;任国家自然科学基金委函评专家和中国生物学会血液净化分会委员。任 Journal of Renewable Materials (SCI 期刊)副主编,Nanomaterials、Materials编委。撰写英文专著1章。

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(责任编辑:xu)
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