NJIT许晓阳教授、上海交大章雪晴教授 AFM: 脂质体-聚合物杂化纳米结构基因递送平台用于可冷冻保存的DNA、mRNA新冠疫苗

2022-07-24 来源：高分子科技

关键词：脂质体聚（β-氨基酯）脂质-聚合物杂化纳米结构 PNP 纳米粒子基因递送

新冠疫情导致全球性大流行病，对公共卫生和全球经济造成灾难性影响已感染超过 5 亿人，导致全球超过 610 万人死亡（根据世界卫生组织于 2022 年 4 月的数据）。通过各方不懈的研究与合作，新一代的核酸疫苗以创纪录的方式被研发出来并及时地部署接种，其中包括由Pfizer-BioNTech和Moderna开发的两款mRNA脂质体纳米粒（mRNA-LNP）新冠疫苗。这两款mRNA-LNP疫苗能够引发高水平的中和抗体滴度并且有着高达 95%的疫苗有效性，在预防 COVID-19上显示出巨大潜力。尽管如此，这两款mRNA-LNP新冠疫苗受到有限保存期和缺乏稳定性的限制，需要将它们保存在 -60 °C 至 -80 °C，以及 -15 °C 至-25°C的环境中，并且同时需要高成本的超冷链的运输条件。目前，冷冻干燥技术已被应用于延长包括小分子药物、疫苗和基于蛋白质的药物在内的多种药剂的保质期。在冷冻保护剂的作用下，冷冻干燥能够溶剂对疫苗的水解作用并且能够使其以干粉形式下长期储存。由于目前的 mRNA-LNP 新冠疫苗全部都是储存在水相溶液中的，因此，这增加了 mRNA 和 LNP 水解的作用从而导致疫苗的不稳定而失效。

近期，美国新泽西理工学院许晓阳教授团队联合上海交通大学药学院章雪晴教授团队开发出一类新型脂质体修饰的聚（β-氨基酯）命名为L-PBAE，并进一步与PLGA-PEG自组装成“Particle-in-Particle”（PNP）新型PNP纳米结构用于DNA和mRNA的体外与体内的递送（图1）。在众多PNP 的纳米材料库中，研究人员证明了PNP/C12-PBAE作为性能最佳的纳米粒子，能够在体外和体内高效地递送DNA和mRNA，并且呈现出增强的转染效果、缓慢持续的DNA和mRNA的释放和至少 12 个月在-20 °C的条件下冻干保存而不会损失转染效率的出色稳定性（图2）。在包裹刺突蛋白编码的DNA和mRNA后，脂质体修饰的 PNP 新冠疫苗即使在 -20°C 冻干储存 12 个月后，仍能在小鼠模型中成功引发刺突蛋白的特异性抗体和 Th1 型的T 细胞免疫反应（图3）。这种新型脂质-聚合物杂化的 PNP 纳米粒子系统为递送DNA 和 mRNA提供了一种新的策略和方法，并且该递送系统具有长期冻干储存的能力。这项工作以“Lipid-polymer hybrid “Particle-in-Particle” nanostructure gene delivery platform explored for lyophilizable DNA and mRNA COVID-19 vaccines”为题发表在《Advanced Functional Materials》（IF=19.92）（DOI：10.1002/adfm.202204462）。该论文的第一作者为新泽西理工学院化工与材料系博士研究生李忠宇。

图 1. PNP/L-PBAE NPs 的表征。(A) PNP/L-PBAE NPs 的一般示意图，PNP由三部分组成：(i) L-PBAE/基因纳米复合物嵌入整个 PLGA-PEG 纳米外壳中，(ii) PLGA层提供持续释放和保护嵌入的L- PBAE/基因纳米复合物，(iii) 外 PEG修饰的纳米颗粒表面。(B) PNP/L-PBAE NPs 的代表性 TEM 图像和 (C) 代表性纳米粒子图像的放大部分。(D) 未嵌入 L-PBAE 的空PLGA-PEG NPs 的代表性 TEM 图像和 (E) L-PBAE/基因纳米复合物的代表性 TEM 图像。(F) PNP/L-PBAE NPs 的大小和 zeta 电位由动态光散射确定。数据表示为平均值±SD（标准偏差）。

图 2. PNP/C12-PBAE NPs 在体外和体内转染效率的综合评定。(A) 在不同时间点由负载 GFP 质粒 (pGFP) 的PNP/C12-PBAE NPs 转染的 Hek 293 细胞的荧光图像以及 FACS 结果。(B) 转染后 GFP 阳性细胞群的总结和 (C) 根据 FACS 结果显示的 GFP 阳性细胞的平均荧光强度 (MFI)。(D) 在不同时间点由负载 mCherry mRNA (mCherry) 的PNP/C12-PBAE NPs 转染的 Hek 293 细胞的荧光图像以及FACS 结果。(E) 根据 FACS 结果对转染后 mCherry 阳性细胞群和 (F) mCherry 阳性细胞的 MFI 进行总结。(G) 与 C12-PBAE NPs 相比，PNP/C12-PBAE NPs具有对 pGFP 和 (H) mRNA 的缓慢持续释放的特性。(I) pGFP和 mRNA负载的PNP 纳米颗粒的琼脂糖凝胶电泳分析。(J) 与对照组相比，在特定时间点注射载有荧光素酶 mRNA (mLuc) 的 PNP (n=3) 后 BALB/c 小鼠的体内生物发光图像。(K) 使用 pGFP 和 (L) mCherry 作为报告基因对 PNP/C12-PBAE NPs 进行长期储存后的评估，通过 FACS 结果进行总结并标准化为新鲜的 PNP 基因表达。(M) 在注射后 1 天后记录 BALB/c 小鼠模型中 PNP 制剂和 ALC-0315 LNP（辉瑞制剂）之间的荧光素酶表达。所有实验一式三份重复，数据表示为平均值±SD。

图 3. PNP 新冠疫苗的体外表征和接种小鼠的体液免疫反应。(A) 在 Hek 293 细胞上转染 DNA-PNP 和 mRNA-PNP 疫苗后刺突蛋白表达的体外蛋白质印迹（WB）。用多克隆抗 SARS-CoV-2 刺突糖蛋白和抗 GAPDH 作为上样对照对细胞裂解物进行探测。(B) 用 DNA-PNP（上排）和 mRNA-PNP（下排）转染的 Hek 293 细胞的体外免疫荧光染色。用多克隆抗 SARS 冠状病毒 2 刺突糖蛋白和 FITC 标记的二抗测量刺突蛋白的表达。细胞核用 DAPI 复染，荧光图像在明场、DAPI、FITC 和合并通道下拍摄（比例尺，50 μm）。(C) 小鼠免疫和样品收集计划示意图。在第0天和第14天分别给予初免和加强疫苗注射，在第0天、第13天、第21天和第35天收集小鼠血清。在第42天取出接种小鼠的脾脏。(D) 通过 ELISA (n = 5) 确定的 mRNA-PNP 疫苗的刺突蛋白特异性 IgG 抗体滴度。(E) mRNA-PNP 疫苗的 SARS-CoV-2 刺突假病毒中和抗体 IC50 滴度 (n=5) 。 (F) 使用 mRNA-PNP 接种小鼠血清 (n=5) 进行针对野生型原始株SARS-CoV-2 毒株病毒的斑块减少中和试验 (PRNT)。(G) 通过 ELISA (n = 5) 确定的 DNA-PNP 疫苗的刺突蛋白特异性 IgG 抗体滴度。(H) DNA-PNP 疫苗的 SARS-CoV-2 刺突假病毒中和抗体 IC50 滴度 (n=5) 。 (I) 使用 DNA-PNP 接种小鼠血清 (n=5) 对野生型原始株SARS-CoV-2 株病毒进行噬菌斑减少中和试验 (PRNT)。所有数据均表示为平均值±SD。使用具有多重比较检验的单向方差分析计算显着性（ns，不显着；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001）。

该工作是团队关于可冻干并且可长期保存的DNA和mRNA新冠疫苗相关研究的最新进展之一。以脂质体杂化的阳离子聚合物L-PBAE和PLGA-PEG为基础，开发出新型PNP聚合物纳米结构用于基因递送以及新冠疫苗的研发，并且为可长时间冻干保存的纳米颗粒基因递送系统提供了一种新的解决方案。

原文链接 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202204462

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（责任编辑：xu）

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