近年来，耐药细菌的持续和快速出现与传播对新型抗菌药物研究提出了迫切需求。宿主防御肽因其广谱抗菌活性且不易产生耐药性的优点而被作为有前景的抗耐药菌感染药物研究新思路被寄予厚望。然宿主防御肽的应用受到易被蛋白酶水解、体内稳定性差、制备成本高等缺点的限制。因此，研究耐蛋白酶水解、合成方便且具有高效抗耐药菌感染能力的宿主防御肽模拟物具有重要意义。

  近日，刘润辉教授课题组报道了一种对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）等多种耐药革兰氏阳性菌具有高效抗菌活性和抗感染治疗潜力的类肽聚合物。该研究成果以“Addressing MRSA Infection and Antibacterial Resistance with Peptoid Polymers”为题发表在Nature Communications上（Nat. Commun. 2021, 12, 5898）。

  作者通过α-NNCA的一锅法开环聚合方便地制备具有不同C-端官能团的抗菌类肽聚合物R-(Naeg)_n。优选类肽分子HS(Naeg)₂₀对 MRSA 等多种耐药阳性菌具有高效抗菌活性，对MRSA休眠细菌和对抗生素高度耐药的MRSA生物膜同样有效，并且使用优选分子HS(Naeg)₂₀连续刺激细菌834代未产生耐药性；在小鼠全皮层感染模型、角膜炎模型和腹膜炎模型中，HS(Naeg)₂₀显示出与最后一线抗生素万古霉素相当的体内抗MRSA感染效果。

图1. 设计并合成具有抗MRSA活性的类肽聚合物

  作者研究了不同端基类肽聚合物对多种革兰氏阳性菌的体外抗菌活性，所有聚合物均展现出有效抗菌活性，其中硫醇封端的类肽活性最好。进一步合成了不同链长的硫醇封端类肽分子HS(Naeg)_n，发现类肽分子对S.aureus ATCC6538的抗菌活性具有链长依赖性，其中20和40 mer链长类肽分子的抗菌活性更优。最终，通过对比研究两种链长聚合物对哺乳动物细胞的毒性，发现HS(Naeg)₂₀具有更低的溶血和细胞毒性以及更高的选择性。进一步研究表明，HS(Naeg)₂₀对其他耐药甚至多重耐药的临床分离菌株都具有高抗菌活性，并且在模拟生理环境的血清或盐的存在下，HS(Naeg)₂₀的活性几乎保持不变。

图2.类肽聚合物具有优异的体外抗菌性能

  为研究类肽聚合物的抗菌机理，作者进行细菌质膜去极化实验，发现HS(Naeg)₂₀对金黄色葡萄球菌仅显示出较弱的膜去极化作用。使用荧光分子标记的聚合物Dye(Naeg)₂₀通过荧光共聚焦显微镜观察其杀菌过程发现，Dye(Naeg)₂₀并未在细菌膜表面富集，而是直接穿过细胞膜进入细胞内部，在细胞质中富集约300 s后，PI进入细菌内部表明细菌膜受损。进一步研究发现，HS(Naeg)₂₀与DNA之间有强烈的相互作用，且细菌与聚合物共孵育后ROS水平在30 min内提高了5.5倍。而通过添加抗氧化剂猝灭大量生成的ROS使其降低至细菌正常水平后，HS(Naeg)₂₀的抗菌活性明显降低。综上，作者推测HS(Naeg)₂₀可能通过与产生高水平ROS和DNA 结合相关的复杂机制来杀菌。高水平ROS可以通过破坏细菌膜来杀死细菌，SEM和TEM表征结果显示HS(Naeg)₂₀处理的金葡菌细胞膜的明显受损且细菌内容物明显减少。

图3.类肽聚合物的抗菌机理

  通过产生过量ROS和DNA结合等多重作用机制， HS(Naeg)₂₀与传统抗生素相比，在治疗抗生素耐药细菌以及生物膜感染和解决细菌耐药性方面显示突出优点：1）连续使用HS(Naeg)₂₀刺激细菌834代，细菌没有产生耐药性，而对于抗生素刺激的细菌很快获得高达1024倍的耐药性；2）与抗生素相比，HS(Naeg)₂₀具有更快的杀菌动力学；3）HS(Naeg)₂₀对MRSA休眠细菌同样具有灭杀能力，而抗生素则无效；4）HS(Naeg)₂₀能够抑制MRSA生物膜形成，并且有效根除抗生素高度耐药的生物膜。

图4. 类肽聚合物具有不易产生耐药性、快速细菌灭杀、根除休眠细菌和生物膜的能力

  作者评估了HS(Naeg)₂₀在小鼠体内抗耐药菌感染的效果。在小鼠全皮层伤口感染模型中，作者使用了MRSA、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌三种耐药阳性菌，结果表明，HS(Naeg)₂₀均显示出相当甚至优于最后一线抗生素万古霉素的体内杀菌活性。此外，在MRSA角膜炎伤口感染模型中，HS(Naeg)₂₀治疗后小鼠眼睛的细菌明显减少，而万古霉素则无效。

图5. 类肽聚合物在小鼠全皮层伤口模型和角膜炎模型中显示出体内抗菌功效

  作者进一步使用腹膜炎模型评估了类肽分子对小鼠全身性感染的治疗效果。实验结果表明，在MRSA、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌三种耐药阳性菌感染的腹膜炎模型中， 通过HS(Naeg)₂₀腹腔单剂量治疗均能大幅度提高感染小鼠的存活率，小鼠主要器官、血液和腹腔液中的细菌负荷分析发现，HS(Naeg)₂₀杀菌效果与万古霉素相当。体内毒性研究表明，HS(Naeg)₂₀给药后小鼠肝脏和肾脏的临床重要生物标志物没有明显差异，在组织学分析中也没有观察到明显的组织损伤。综上，在多种耐药阳性菌感染的多种动物模型中HS(Naeg)₂₀均显示出有效的体内抗感染效果。

图6. 类肽聚合物在小鼠腹膜炎模型中显示出体内抗菌功效同时没有明显体内毒性

  尽管类肽已被作为宿主防御肽抗菌模拟物来探索，用以应对抗生素耐药性细菌感染的巨大挑战。然而，固相合成成本高、耗时长且难以大规模合成的缺点，阻碍了类肽的发展应用。作者通过α-NNCA一锅法开环聚合制备的抗菌类肽聚合物，具有低成本、容易大规模合成、结构多样性等优点。重要的是，优选类肽分子在多种动物模型中均展示出高效的体内抗感染效果，结合其不易产生耐药性等诸多优点，使其在抗耐药微生物感染领域具有广泛的应用前景。

  华东理工大学博士研究生谢佳洋和周敏博士是该论文的第一作者，华东理工大学刘润辉教授是通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金委、科技部等基金的资助。

  论文链接: https://www.nature.com/articles/s41467-021-26221-y