免疫治疗已发展成为继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗手段。其中，基于T细胞的过继性细胞免疫疗法（ACT）是一大热点研究方向，其策略是体外分离、修饰改造和扩增患者的T细胞后回输患者体内，以激发自身免疫系统产生对肿瘤的杀伤能力。目前，这种手段已在部分实体瘤治疗中表现出良好的效果。然而，在治疗及疗效评价过程中，如何对T细胞及其活力进行实时监测示踪仍是亟待解决的重要技术难题。
钙离子（Ca2+）作为细胞内的第二信使，与细胞增殖死亡、组织器官发育中的许多生化反应过程密切相关。在T细胞中，钙离子同样有着关键的调节作用，其浓度水平可以反映T细胞的激活状态。基于这一原理，东华大学史向阳教授团队设计构建了一种可用于T细胞CT和荧光双模态成像的树状大分子包裹纳米金颗粒探针（{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2} DENPs），实现T细胞及其活力监测和示踪。课题组以第五代聚酰胺胺（PAMAM）树状大分子为平台，在其内部包裹纳米金颗粒用于CT成像，外围通过酯键共价修饰钙信号传感分子Fluo-4用于荧光成像（图1）。Fluo-4具有很高的钙离子亲和力，当它以游离形式存在时几乎无荧光，但与细胞内钙离子结合后则会激发出较强的绿色荧光，从而可以直观地反映T细胞内钙离子的水平及T细胞的激活状态。
图 1. 纳米探针 {(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2} DENPs的合成示意图。
研究团队通过核磁共振氢谱、紫外吸收光谱和荧光发射光谱等手段对获得的探针材料进行表征，结果均显示Fluo-4可成功修饰于树状大分子表面（图2）。探针的细胞相容性良好，在浓度达到5 μM时，仍能保证T细胞维持90 %以上细胞活力。同时探针也具有较高的T细胞摄取效率，探针对T细胞的标记效率高达84.6%。
图 2. （a）未连接Fluo-4的对照组 {(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14 DENPs（绿）、探针 {(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2} DENPs（红）、游离态Fluo-4（蓝）、商用钙荧光探针Fluo-4, AM（紫）的紫外吸收光谱图；（b）游离态Fluo-4（绿）、商用钙荧光探针Fluo-4, AM（红）、探针{(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2} DENPs（蓝）在Ca-EGTA高钙缓冲溶液中的荧光发射光谱图。
为了验证纳米探针对T细胞的活力探测，研究团队利用联合激活剂PMA/Iono活化T细胞，首先通过测试T细胞分泌的细胞因子γ-干扰素和白介素-2确认T细胞的激活。进而采用探针对不同活化时间后的T细胞进行检测，结果表明修饰了Fluo-4的树状大分子纳米探针在被T细胞摄取后，探针上连接的Fluo-4分子能够被胞内酯酶剪切而游离出来，与钙离子结合并产生荧光，显示出和商用钙荧光探针Fluo-4, AM相近的胞内荧光成像效果。同时，随着活化时间的延长，胞内钙离子浓度上升，荧光强度也随之提升，显示出探针具有动态监测T细胞激活状态的潜力（图3）。
图3. PBS、探针 {(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2} DENPs、商用钙荧光探针Fluo-4, AM与被PMA/Iono活化0、4、18小时的T细胞共孵育4小时后的荧光检测结果。（a）激光共聚焦显微镜荧光图；（b）流式细胞术荧光强度检测结果；（c）流式细胞术荧光强度结果分析直方图。
随后，课题组将标记了纳米探针的激活的T细胞注射在小鼠皮下，进而通过CT和活体荧光显像监测T细胞的定位。研究发现，注射五分钟后，注射部位即能发现明显增强的CT信号，同时荧光强度也有所增加（图4）。两种成像结果互相印证，显示所合成的纳米探针在标记T 细胞后能够实现其在小鼠体内的CT/荧光双模态成像示踪。
图 4. PMA/Iono活化18小时的T细胞标记探针 {(Au0)25-G5.NHAc-(PEG)14-(Fluo-4)2} DENPs后，在小鼠背部皮下注射后的T细胞成像示踪结果。（a）CT成像结果图；（b）注射前后CT信号值；（c）小动物荧光成像结果图；（d）注射前后相对荧光强度。
以上研究以“Multifunctional Dendrimer-Entrapped Gold Nanoparticles for Labeling and Tracking T Cells Via Dual-Modal Computed Tomography and Fluorescence Imaging”为题，发表在美国化学会期刊Biomacromolecules (DOI: 10.1021/acs.biomac.0c00147)上。第一作者为东华大学化学化工与生物工程学院的硕士研究生陈玫秀，东华大学的史向阳教授和以色列巴伊兰大学的Rachela Popovtzer教授为共同通讯作者。该工作得到了国家重点研发计划政府间国际科技创新合作重点专项项目、国家自然基金委、上海市科委等项目的资助。
论文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.biomac.0c00147
