近日美国化学学会国际顶级期刊《Journal of the American Chemical Society》（JACS）刊发了华中科技大学武汉光电国家研究中心舒学文教授与化学与化工学院朱锦涛教授、南京邮电大学材料科学与工程学院赵强教授合作论文“细胞穿膜肽转运非共价连接的热致延迟荧光纳米粒子用于时间分辨的发光成像”（“Cell-Penetrating Peptides Transport Noncovalently Linked Thermally Activated Delayed Fluorescence Nanoparticles for Time-Resolved Luminescence Imaging”）。舒学文教授、朱锦涛教授和赵强教授为共同通讯作者，华中大武汉光电国家研究中心博士后朱泽策和化学与化工学院博士后田迪为论文共同第一作者；华中大为论文第一单位。
具有长寿命激发态的荧光磷光探针在时间分辨（time-resolved）生物成像中具有重要的应用。相对于稳态荧光成像，时间门控成像（time-gated imaging）或荧光寿命成像（luminescence lifetime imaging）等时间分辨技术可以选择性检测长寿命的发光，达到去除散射光和生物自荧光干扰的目的。大多数长寿命激发态的生物探针为过渡金属配合物或无机金属粒子材料，主要是磷光材料。为了避免过渡金属的毒副作用，人们一直在发展无金属的长寿命激发态材料。延迟荧光（Thermally Activated Delayed Fluorescence，TADF）材料是近些年发展的一类重要的非金属荧光材料，在有机发光二极管领域应用广泛。这类材料的长寿命荧光源于激发三重态的反向系间窜越，其寿命通常在微秒至毫秒量级，与一般的过渡金属配合物的激发态寿命相当，因而是非金属型长寿命激发态探针的强力候选。
然而，分子运动容易导致延迟荧光激发态的非辐射弛豫，而且激发三重态易被氧分子猝灭，导致其在溶解状态下的的发光较弱，难以运用在生物成像中。近些年虽然有一些工作尝试将延迟荧光分子探针用于时间分辨的生物成像，但是应用范围非常有限。为此，人们发展了延迟荧光纳米探针，使用两亲聚合物包裹疏水的延迟荧光分子形成纳米粒子，进而用于生物成像。但是，这些纳米粒子大多缺乏生物相容性，不能快速进入细胞，以至于需要数小时的孵育时间，不利于实时荧光成像。
基于上述背景，本工作首次将细胞穿膜肽（Cell-Penetrating Peptides）用于延迟荧光纳米粒子的细胞跨膜转运：构建了一条由六聚苯丙氨酸、六聚甘氨酸和八聚精氨酸组成的一条两亲性穿膜肽，用于组织延迟荧光纳米粒子（图1）。该肽链的八聚精氨起穿膜作用，六聚苯丙氨酸为疏水端，可通过非共价的疏水作用结合一些水不溶的延迟荧光分子。通过一步自组装的方法，该肽链可以与三个经典的疏水延迟荧光分子分别组装形成不同荧光颜色的纳米粒子。
图1、两亲性穿膜肽与延迟荧光分子组装形成纳米粒子
经过方法优化，可形成粒径在90-300 nm范围内的粒子，在这些粒子表面附着的穿膜肽作用下，这些粒子可以较好分散在水溶液中，并可以较快进入细胞。荧光共聚焦成像和流式细胞术结果表明，经过5分钟孵育就可以检测到细胞内有这些粒子的荧光信号，充分说明了穿膜肽可介导非共价连接的粒子进行跨膜转运。此外，由于疏水分子聚集在粒子内部，可以有效抑制氧分子的扩散和分子的非辐射热弛豫，因而这些粒子在室温有氧条件下也具有长寿命的延迟荧光，粒子在有氧条件下的寿命在微秒级以上，通过几十到数百纳秒的延迟，这些长寿命发光信号可以与散射光、短寿命自荧光区分开来（图2）。时间分辨荧光成像结果表明，经过1小时的孵育后，可以显著检测到细胞内的长寿命荧光信号（图3）。
图2、纳米粒子分散液的吸收、稳态和延迟的荧光光谱（a、c、e），及发光随时间的衰减变化 （b、d、f）。[4CzIPN] = [NAI-DPAC] = [BTZ-DMAC] =12.5 μg/mL。
图3、纳米粒子用于时间分辨的细胞荧光成像。[4CzIPN] = [NAI-DPAC] = [BTZ-DMAC] = 1.6 μg/mL.
相对于其它方法制备的延迟荧光纳米粒子，这些粒子具有较快的穿膜速率。相对于共价修饰穿膜肽的荧光探针，该工作仅用一条穿膜肽实现了三种非共价连接的分子进入细胞，其操作方法更简便，成本更低。
这种方法可以用于其它疏水分子或粒子的跨膜转运，即不需要对现有的延迟荧光分子进行化学修饰就可以将其用于细胞的时间分辨成像，对降低散射光和生物自荧光干扰方面具有重要的意义。此外，这种两亲性穿膜肽的设计思路有望运用到其它肽链的设计中，并在荧光、药物分子和纳米粒子的跨膜运输方面具有潜在的应用。
该工作得到国家自然科学基金（51603152，51525302，61775074，61825503）和中国博士后基金（2017M620315，2018T110757）的资助。
