清华大学陈国强教授、吴琼副教授 Adv. Sci.: 以聚羟基脂肪酸酯为例探究细胞体积大小对工业生产的影响
大多数细菌只有1~2微米大，这样微小的空间限制了胞内产物（如聚羟基脂肪酸酯，PHA）的积累。细胞体积的大小主要受mreB、minCD等关键基因的调控，但改变这些基因的表达量对生长产生负面影响。因此，开发一种在不影响细胞生长的前提下增大细胞体积的方法显得尤为重要。本研究通过改造细菌内的ClpXP蛋白降解系统，实现对MreB蛋白的可控降解。在此基础上，通过过表达PHA合成相关基因phaAB并敲除PHA颗粒表面蛋白PhaP1，成功实现了细胞体积的显著增大（超过9倍）以及PHA产量的提升。在5吨发酵罐中，改造后的盐单胞菌CYL0307在发酵44小时后，干重达到149g/L，PHA含量达到82%。
细菌的微小体积限制了胞内产物的积累，然而对细胞骨架蛋白MreB以及分裂相关蛋白MinCD的调控对细菌生长造成负面影响。因此，需要开发一种在不影响细菌生长的前提下增大细胞体积的方法。本研究改造细菌内的ClpXP蛋白降解系统并将其应用于MreB的可控降解，在此基础上敲除PHA颗粒表面蛋白PhaP1同时过表达PHA合成相关基因phaAB，最终成功实现了细胞体积的显著增大（九倍以上），PHA产量的提高和下游提取过程的简化。
细菌内有多种蛋白降解系统，其中研究最为广泛的是ClpXP蛋白降解系统。在翻译过程中，当蛋白质在核糖体上发生停滞时，细菌内的tmRNA（transfer-messenger RNA）会在停滞蛋白的C端加上SsrA标签。该SsrA标签可以与细菌内的ClpXP蛋白酶特异性结合，从而促使停滞蛋白被降解。在本研究中，他们通过突变SsrA标签的序列，调节其与ClpXP蛋白酶之间的相互作用强度，进而开发出一系列具有不同降解速率的突变标签（图1）。
图1 突变后具有不同降解速率的标签
在此基础上，他们将突变后具有不同降解速率的SsrA标签的DNA序列插入细菌基因组中mreB基因的终止密码子前，使MreB蛋白在翻译时就带有SsrA标签。鉴于MreB蛋白在维持细菌杆状形态中的关键作用，通过调节其降解速率，他们期望能够增加细菌宽度，获得更接近球形的细菌。通过显微镜观察，他们发现所有经过基因编辑的细菌均呈现出更大的椭球状形态，而对照菌株CYL0119则保持了较小的杆状形态（图2A）。进一步测试这些细菌的干重和PHA含量后发现，与对照菌株相比，经过改造的工程菌株CYL0212的干重和PHA含量分别提高了14.2%和5%。（图2B）。
图2 降解MreB蛋白对细菌形态和PHA生产性能的影响
为了进一步增大细菌的体积，在CYL0212中过表达了minCD基因，MinCD蛋白与细胞分裂环的形成密切相关，其表达水平提高能抑制细胞分裂，使细胞变长。显微镜观察结果显示，过表达minCD确实进一步增大了椭球形细菌的体积（图3A）。然而，在测量细胞干重和PHA含量后发现，这一操作显著降低了细胞干重和PHA含量。因此，仅降解MreB的菌株被用于后续实验（图3B）。
图3 通过过表达minCD进一步增大细胞体积，但降低干重和PHA含量
先前的研究表明，敲除PHA表面结合蛋白PhaP1会导致PHA颗粒发生融合，形成更大的颗粒，这有利于工业生产中的PHA提取过程。基于这一发现，他们在菌株CYL0212中敲除了phaP1基因，构建了工程菌株CYL0213，并利用透射电子显微镜对其内部的PHA颗粒进行了观察（图4A）。结果表明，当phaP1基因被敲除后，PHA颗粒的直径从0.63微米增加至1.67微米（图4B）。考虑到椭球形细菌体积的增大为其提供了更多空间用于PHA积累，他们在CYL0213中过表达了PHA合成相关基因phaAB，构建了工程菌CYL0307，与对照菌株相比，CYL0307的细胞干重从17.2g/L提高至20.8g/L， PHA含量从73.3%提高至78.4%（图4C）。
图4 通过敲除phaP1和过表达phaAB优化PHA的生产过程
接下来，他们将CYL0307用于7升、100升以及5吨发酵罐中进行PHA生产，以评估其在工业生产和提取过程中的性能表现。在PHA生产能力方面，结果显示，工程菌CYL0307在不同规模发酵罐中的PHA产量均优于对照菌株。特别是在5吨发酵罐中，经过44小时发酵，CYL0307的细胞干重高达149g/L，PHA含量达到82%。而对照菌株在相同条件下干重仅为104g/L，PHA含量仅76%。在下游提取过程中，CYL0307也展现出多方面的优势。首先，由于工程菌更大更重，其在发酵液中的沉降性能显著增强，更易通过离心分离。在4000转/分钟的条件下，工程菌仅需离心4分钟即可从发酵液中完全分离，而对照菌株则无法实现有效分离（图5A）。其次，工程菌从杆状转变为球状，细胞壁被延展，表面变得粗糙不平，这种结构变化说明细胞壁被破坏，从而可以更高效地提取胞内PHA颗粒。与对照菌株相比，工程菌在破壁过程中溶菌酶使用量减少了28%（图5B和5C）。此外，通过扫描电子显微镜观察发酵结束后的菌株的形态，并计算其体积，结果显示，CYL0307呈现出球状结构，体积较对照菌株增大九倍以上（图5D和5E）。
图5 球形菌的下游提取优势
总结：本研究在非模式菌盐单胞菌中开发了一种基于翻译后修饰的蛋白质降解技术，实现了对目标蛋白MreB的可控降解。在此基础上，通过敲除phaP1和过表达phaAB，成功使细菌体积增大九倍以上，并显著提高了PHA的产量。此外，该技术还简化了下游离心分离过程，并减少了溶菌酶的使用量，从而提升了PHA生产的效率和经济性。文章第一作者为清华大学生命科学学院博士生陈翊苓，文章通讯作者为清华大学生命科学学院陈国强教授和吴琼副教授。
链接地址：https://doi.org/10.1002/advs.202412256
陈国强教授简介
陈国强，1994年被聘为清华大学副教授，1997－今聘为清华大学教授，2003－2009年兼任汕头大学多学科研究中心主任。长期从事“生物合成PHA材料及其下一代工业生物技术”的研究。学术论文在Google Scholar引用4万多次，H指数105。获得授权专利70多项，50个公开专利。开发的PHA技术已经在数家公司用于大规模生产微生物塑料聚羟基脂肪酸酯PHA，使我国成为PHA领域国际上学术和产业最发达的国家、以及PHA医学应用研究做多的国家，开发了多种PHA以及降解单体的多种应用。获得的荣誉包括：国际生物聚合物（ISBP）工业奖（2024）；国际代谢工程奖（2023）、自然资源科学技术二等奖（2022）、全国先进科技工作者（2016）、候德傍化工创新奖（2015）、首届闵恩泽能源化工杰出贡献奖（2013）、谈家祯生命科学创新奖（2011）、教育部长江学者特聘教授（2004）、教育部高校青年教师奖（2004）、第八届中国青年科技奖（2003）、纽伦堡国际发明奖（2003）、茅以升科技奖（2003）、自然科学基金委国家杰出青年（2002）、 国家发明二等奖(排名第一)（2002）等。是973“合成生物学”项目以及国家重大专项项目的首席科学家、清华大学合成与系统生物学中心主任、英国曼彻斯特大学兼职讲座教授。曾连续6年获得清华大学学生“良师益友”的光荣称号，进入清华大学“良师益友”名人堂。连续9年获得清华大学高论文他引的“梅贻琦奖”。连续八年获得Elsevier出版社生化与分子生物学高引用作者。学术服务：担任国际期刊《Biotechnology Advances》和《Synthetic and Systems Biotechnology》主编，《生物工程学报》、《合成生物学》、《Journal of Biotechnology》 、《Microbial Cell Factories》、《Biotechnology Journal》和《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》副主编。另担任国际学术期刊编委《Trends in Biotechnology》、《Current Opinions in Biotechnology》、《Metabolic Engineering》、《ACS Synthetic Biology》、《Microbial Biotechnology》、《Applied Microbiology and Biotechnology》、《Biomaterials》、《Biomacromolecules》和《Metabolic Engineering Communications》。
电邮: chengq@tsinghua.edu.cn
个人网站:http://life.tsinghua.edu.cn/publish/smkx/11529/2018/20180518020832465292446/20180518020832465292446_.html
https://www.researchgate.net/profile/Guo-Qiang-Chen-2/stats
