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天津工业大学高辉教授团队 Nano Today:利用GalNAc衍生的纳米平台阻断Fn-宿主细胞相互作用以增强结直肠癌的化疗效果
2024-05-08  来源:高分子科技

  结直肠癌(CRC)是发生在结直肠部位的消化道恶性肿瘤,其全球死亡率在恶性肿瘤中高居第二位。对于CRC中晚期患者来说化疗仍是主要治疗策略。然而,化疗耐药性导致的复发和转移使得化疗的疗效面临严峻挑战越来越多的证据表明CRC化疗后复发与一种特的肠道微生物-具核梭杆菌(Fn)密切相关Fn能够通过其表面的凝集素Fap2CRC细胞表面过度表达的Gal-GalNAc特异性结合黏附CRC细胞,而CRC部位Fn的异常增殖会促进肿瘤的发展和转移,诱导CRC细胞产生化疗耐药性。因此针对Fn进行靶向干预,减少其在肿瘤组织内的定植,有望显著增强化疗的治疗效果,并降低癌症复发的风险。


  为此,天津工业大学高辉教授团队提出了一种特异性抗Fn黏附策略,通过构建GalNAc衍生纳米平台(OGPA/P-C)来改善CRC的化疗这种CRC微环境适应性纳米平台可在肿瘤内靶向递送抗癌药物奥沙利铂(OxPt),同时阻断Fn与宿主细胞的相互作用,从而逆转Fn引起的耐药性,提高化疗效果(图1)。研究团队首先将OxPt和偶氮苯(AZO)偶联到GalNAc修饰的寡聚聚乙烯亚胺(OEI)上,再通过聚乙二醇-β-环糊精(PEG-CD)和偶氮苯基团的主客体相互作用组装得到最终的纳米平台OGPA/P-C。其中PEG组分在纳米表面形成的“隐形”保护层,不仅可以屏蔽GalNAc介导的肝脏靶向作用、还可以延长纳米药物的循环时间并增强其在肿瘤组织的蓄积;而在CRC相关偶氮还原酶触发下纳米平台解组装使得GalNAc暴露并通过Fap2依赖性竞争机制阻止Fn黏附于CRC上,逆转Fn诱导的化疗耐药性;局部释放化疗药物OxPt,有效增强抗肿瘤效果。 


图1. GalNAc衍生的抗黏附纳米平台通过阻断Fn-宿主相互作用以增强CRC化疗的示意图。(a)OGPA的制备及其与PEG-CD通过超分子自组装得到OGPA/P-C。(b)OGPA/P-C对Fn感染的CRC的治疗机制:i)屏蔽GalNAc介导的肝脏靶向作用、延长纳米药物的血液循环时间并增强其在肿瘤组织的蓄积;ii)在CRC相关偶氮还原酶触发下暴露GalNAc靶向Fn,干扰Fap2-Gal-GalNAc相互作用,从而阻断Fn与CRC细胞的黏附,逆转Fn诱导的化疗耐药性。iii)局部释放化疗药物OxPt,有效消融CRC肿瘤。


  研究团队首先测定了OGPA/P-C的纳米粒径,血液稳定性以及其在肿瘤微环境中的响应性释放药物能力。如图2c-d所示OGPA/P-C纳米平台的平均流体力学直径为169.7 nm,SEM观察到其形态为均匀的球形。此外,为了证明该纳米粒子的稳定性,测定了其与含有10%血清的PBS共同培养孵育后的粒径变化。结果显示在长达100小时内OGPA/P-C纳米平台的粒径大小和PDI没有显著变化,表明该纳米平台在血液中具有极佳的稳定性(图2e)。此外,还利用Na2S2O4作为CRC相关偶氮还原酶的模拟物来确定纳米平台的刺激响应行为。如图2c所示,经Na2S2O4处理后,由于OGPA和P-C之间的结构被破坏OGPA/P-C平均流体力学直径从169.7 nm增至385.2 nm。紫外可见光谱也进一步证明了该结构的变化(图2f)。通过ICP-MS对药物释放行为进行了测定,结果显示OGPA/P-C纳米平台可在模拟CRC微环境中发生解离,从而触发药物的按需释放(图2g)。 


图2. GalNAc衍生的抗黏附纳米平台的合成与表征。(a)OGPA/P-C的制备示意图。(b)OGPA和OGPA/P-C的紫外可见光谱。(c)通过DLS测定在有/无Na2S2O4情况下OGPA/P-C纳米平台的水合粒径分布。(d)OGPA/P-C的SEM图像。(e)OGPA/P-C纳米平台在10%血清溶液中培养后的水合粒径和PDI。(f)Na2S2O4存在(蓝线)和不存在(红线)时OGPA/P-C纳米平台的紫外可见光谱。(g)在有/无Na2S2O4情况下,Pt从OGPA/P-C纳米平台中的累积释放曲线。


  研究人员随后探究了OGPA/P-C与Fn的靶向结合机制(图3a)。如图3b所示,在与负载ICG的OGPA/P-C(ICG@OGPA/P-C)共培养后,细菌周围没有荧光产生,表明ICG@OGPA/P-C与Fn没有结合。但在加入偶氮还原酶后可以观察到明显的红色荧光,且荧光强度与OGPA组相当,该结果表明,在偶氮还原酶作用下PEG脱屏蔽,暴露的GalNAc会与Fn产生强大的结合效应。此外,当Fn与游离的GalNAc孵育后再用负载ICG的OGPA(ICG@OGPA)处理时,细菌的红色荧光会大幅减少,这表明OGPA与Fn的结合是由Fap2-GalNAc相互作用介导的。 


图3. OGPA/P-C与Fn的靶向结合。(a)OGPA/P-C与Fn的结合机制。(b)CLSM观察不同组分处理后的Fn
接下来研究人员在体外测定了OPGA/P-C对Fn黏附肿瘤细胞的抑制作用(图4a)。结果表明,CT26和HCT116两种细胞都有较高的Gal-GalNAc表达水平,并且GalNAc和GalNAc衍生的纳米平台都具有抑制Fn在CT26和HCT116细胞表面定植的能力(图4b-i)。 


图4. 体外抑制Fn黏附CRC细胞。(a)OGPA/P-C阻断Fn黏附CRC细胞示意图。(b)CLSM图像显示FITC标记的Fn与CT26和(c)HCT116细胞的黏附情况。(d-e)FITC荧光定量分析。(f)CLSM图像显示CT26和(g)HCT116细胞经不同样品处理后Fn的黏附情况。(h-i)FITC荧光定量分析。


  为了进一步验证GalNAc是否可以通过抑制Fn对CRC细胞的黏附从而逆转CRC细胞的化疗耐药性,在Fn感染的细胞模型中评估了纳米平台的抗肿瘤活性。结果显示OxPt对Fn感染细胞的细胞毒性显著降低,即Fn可诱导HCT116和CT26细胞对OxPt产生化学耐药性。然而,在加入游离的GalNAc以后,CT26/Fn和HCT16/Fn组细胞的存活率均有所下降,并且随着GalNAc浓度的不断增加,细胞的存活率呈现出比较明显的下降趋势,该结果表明GalNAc可以克服Fn诱导的CRC耐药性(图5a-b)。随后进一步研究了OGPA/P-C对Fn感染的CRC细胞的作用。如图5c-d所示,用含有GalNAc的OGP和OGPA/P-C处理Fn感染的CT26和HCT116细胞后,其细胞活力低于不含GalNAc的OP和OPA/P-C,该结果表明GalNAc衍生的纳米平台可通过阻断Fn-宿主细胞间的相互作用有效逆转CRC细胞的耐药性。研究表明,Fn通过激活自噬途径诱导CRC的化疗耐药性,进一步损害化疗效果。因此研究人员使用AO染色法和蛋白印迹法评估了Fn感染的CT26细胞在不同组分处理后的自噬活性。结果表明Fn会诱导CT26细胞发生自噬,而用OGPA/P-C处理Fn感染的CT26细胞后,其自噬活性显著降低(图5e-f)。即OGPA/P-C通过阻断Fn对CRC细胞的黏附可有效抑制Fn诱导的自噬激活进而克服化疗耐药性(图5g)。


  随后在BALB/c雄性小鼠肿瘤模型中,利用尾静脉注射ICG标记的OGPA、OGPA/P-C和游离ICG来评估药物在体内的生物分布以及在肿瘤部位的积累。结果如图5h-j所示,在整个检测期间OGPA/P-C组在肿瘤中的富集程度最高。在注射后24小时,由于GalNAc具有很强的肝脏靶向能力,OGPA大量积聚在肝脏中,而OGPA/P-C则积聚在肿瘤部位,这些结果表明,PEG的引入很好的屏蔽了GalNAc的肝脏靶向性。 


图5. 体外抗肿瘤活性和体内生物分布评估。(a)OxPt和GalNAc对CT26和Fn感染的CT26细胞的细胞毒性。(b)OxPt和GalNAc对HCT116和Fn感染的HCT116细胞的细胞毒性。(c)含有不同Pt浓度的样品对CT26和Fn感染的CT26细胞的细胞毒性。(d)不同Pt浓度(0-100 μM)的样品对HCT116和Fn感染的HCT116细胞的细胞毒性。(e)经PBS、OPA/P-C和OGPA/P-C处理后,Fn感染CT26细胞的AO染色图像。(f)相应的红绿比定量分析。(g)OGPA/P-C通过阻断Fn-宿主相互作用和抑制自噬激活来恢复OxPt活性示意图。(h)ICG、ICG@OGPA和ICG@OGPA/P-C经尾静脉注射到携带CT26肿瘤的BALB/c小鼠体内后0.5、1、3、6、9和24小时的生物分布(n = 3)。(i)体内成像和(j)给药后24小时离体器官和肿瘤中ICG的荧光定量分析。


  最后研究团队探究了OGPA/P-C在体内的抗肿瘤效果。通过对小鼠肿瘤体积,小鼠体重、存活率以及主要器官的检测,发现相比于传统抗肿瘤药物OxPt,OGPA/P-C具有更优越的体内抗肿瘤效果和更显著的生物安全性,并且结合免疫组化实验结果进一步说明OGPA/P-C可通过阻断Fn与CRC细胞的黏附,从而抑制自噬激活,克服Fn诱导的化疗耐药性(图6a-g)。 


图6. 抗黏附和体内抗肿瘤性能。(a)小鼠接种肿瘤细胞和治疗示意图。(b)不同治疗后小鼠肿瘤生长曲线(n = 6)。(c)治疗15天后切除肿瘤的代表性照片。(d)不同样品治疗后小鼠在40天内的存活率。其中(+)和(-)指静脉注射Fn与否。(e)具有代表性的肿瘤切片免疫组化染色。(f)不同样品治疗后小鼠体重的变化。(g)小鼠在不同样品治疗后主要器官和肿瘤的代表性H&E染色图像。


  总之,该研究团队成功开发了一种非致死性策略,通过利用GalNAc衍生的抗黏附纳米平台(OGPA/P-C)特异性阻断Fn-宿主细胞相互作用来逆转Fn诱导的化疗耐药性,从而增强Fn相关CRC的化疗效果。该团队提出的非致死性抗黏附策略为提高Fn感染的CRC和其他实体瘤的化疗效果提供了一种创新思路。


  以上研究成果以“Blocking Fusobacterium nucleatum-host cell interactions with responsive supramolecular GalNAc-derived nanoplatform for enhanced chemotherapy in colorectal cancer”为题,发表于期刊Nano Today(2024, 24, 102288. DOI: 10.1016/j.nantod.2024.102288)。天津工业大学高辉教授和余云健讲师为通讯作者,天津工业大学武腾玲讲师和天津理工大学硕士研究生靳丹阳为共同第一作者。这项工作得到了国家自然科学基金、天津市自然科学基金重点项目、天津市特聘教授以及天津市透明质酸应用研究企业重点实验室开放基金的支持。


  文章链接:https://doi.org/10.1016/j.nantod.2024.102288

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(责任编辑:xu)
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