东华大学郭睿教授/史向阳教授课题组《ACS AMI》：双响应核壳树状分子用于肿瘤细胞的基因编辑增强免疫检查点阻断治疗

2023-03-24 来源：高分子科技

关键词：免疫检查点阻断疗法 PD-L1 CRISPR/Cas9 双响应核壳结构树状大分子 CT成像

免疫检查点阻断（ICB）疗法通过激活免疫系统来抑制肿瘤的发生和转移，已成为一种极具前景的治疗策略。在众多的检查点中，程序性死亡配体1（PD-L1）被认为是肿瘤相关免疫抑制和肿瘤进展的关键调节因子，已被用作临床治疗实体肿瘤的治疗靶点。目前，常用单克隆抗体或小干扰RNA（siRNA）来阻断PD-L1/PD-1通路，但存在耐久性差、免疫反应低等问题。因此，永久性、特异性地抑制肿瘤细胞中PD-L1基因的表达，有望实现更有效、更持久ICB治疗。

作为一种前沿的基因组编辑工具，聚类规则穿插短回文重复序列（CRISPR）-相关蛋白9（CRISPR/Cas9）系统为癌症的治疗提供了新的思路。CRISPR/Cas9具有精确高效的基因编辑能力，能够在sgRNA的引导下识别特定的DNA序列，并通过Cas9核酸内切酶切割目标PD-L1基因，调控肿瘤细胞PD-L1的表达。在肿瘤治疗中，基于质粒的CRISPR/Cas9系统因其结构简单、成本低、整合效率高而被广泛应用。提高靶标特异性和基因编辑效率是CRISPR/Cas9系统在免疫治疗中的关键，因此迫切需要开发靶向肿瘤和响应性的纳米载体，以精确和有效地在肿瘤细胞内传递CRISPR/Cas9质粒。

东华大学郭睿教授/史向阳教授课题组构建了一种双响应的负载Au纳米颗粒核壳结构树状大分子纳米平台（Au CSTDs），用于有效压缩和响应性释放“切除PD-L1基因的CRISPR/Cas9质粒”（Cas9-PD-L1），实现肿瘤靶向的高效、持久的ICB治疗（图1）。研究团队首先以包裹金纳米颗粒、乳酸（LA）修饰的第五代聚酰胺-胺树状大分子为核心，以连接苯硼酸（PBA）的第三代树状大分子为外壳，通过LA和PBA形成苯硼酸酯键构建了pH/ROS响应的负载金纳米颗粒的核壳树状大分子Au CSTDs。通过其表面PBA与肿瘤细胞中过表达的唾液酸结合完成特异性的肿瘤传递，并在肿瘤弱酸性和高ROS下解离，实现Cas9-PD-L1的响应性释放和有效转染、敲除肿瘤细胞的PD-L1基因，实现持久高效的ICB免疫治疗。其中，金纳米颗粒在提高基因转染效率的同时，可以实现CT成像可视化追踪。

图1. (Au⁰)₂₅-G5-LA/PBA-G3（Au CSTDs）的合成方案及基于ICB癌症免疫治疗的CRISPR/Cas9传递机制

研究团队通过¹H NMR、UV-vis和2D NOESY证明了金纳米颗粒的成功包裹以及核壳树状大分子的成功构建（图2A-C）。TEM、AFM以及水合粒径分布图显示出Au CSTDs呈球形，且大小均一（图2D-F）。Au CSTDs的红细胞溶血率低于5%，具有良好的血液相容性。此外，通过荧光光谱分析验证了苯硼酸酯键在低pH和高H₂O₂的响应性断裂，这将导致Au CSTDs在肿瘤微环境下发生pH和H₂O₂响应性分解（图2H和I）。

图2. (A) (Au⁰)₂₅-G5-LA、G3-PBA和Au CSTDs的¹H NMR谱。(B) G5-LA、(Au⁰)₂₅-G5-LA和Au CSTDs的紫外-可见光谱。(C) Au CSTDs的2D NOESY光谱。(D) Au CSTDs的TEM图像和大小分布直方图。(E)AFM图像和Au CSTDs的高度轮廓。(F)各物质在水中的水合粒径图。(G)不同浓度的Au CSTDs对小鼠的溶血率。阳性对照为1%的Triton X-100 (TX-100)，阴性对照为PBS。插图显示了与材料共孵育2小时离心后的照片。(H) Au CSTDs在pH为7.4、6.4和5.4时的荧光激发光谱。(I) Au CSTDs在含H₂O₂ (0.1 mM) pH = 7.4的荧光激发光谱。所有激发光谱均使用388 nm的发射波长。PBA的浓度固定在1 mM。

研究团队构建了CRISPR/Cas9质粒系统，其中包含了sg RNA、Cas9蛋白以及增强型绿色荧光蛋白的DNA序列，用于后续的实验（图3A）。琼脂糖凝胶阻滞实验表明，当N/P为1时材料可将质粒完全压缩（图2B），将载体/质粒复合物置于低pH和H₂O₂存在条件下，Au CSTDs可以响应断裂且释放出质粒（图2C）。图2D验证高N/P条件下，纳米复合物在肿瘤微环境条件下水合粒径明显增大，结构变得松散，利于质粒的释放。因此，Au CSTDs可以作为载体来压缩和响应性释放CRISPR/Cas9质粒系统。随后，研究团队进行了细胞实验，CCK-8实验证明材料具有良好的细胞相容性（图2E），绿色荧光蛋白转染实验表明，核壳结构可以有效转染质粒，并且最佳N/P为15（图2F和G）。

图3. (A) Cas9-PD-L1质粒和靶向PD-L1的sgRNA序列。(B)不同N/P比下， Au CSTDs压缩Cas9-PD-L1质粒的琼脂糖凝胶阻滞试验。1：DNA Marker (5000 bp)；2：游离Cas9-PD-L1；3?8：N/P比分别为0.125、0.25、0.5、1、2和5。(C) N/P = 10时，在不同环境下Au CSTDs压缩Cas9-PD-L1质粒的琼脂糖凝胶阻滞试验。(D)不同N/P比下Vector/Cas9-PD-L1的水合粒径。(E)不同载体浓度的Vector、Vector/Cas9-PD-L1和Vector/ Cas9-NC处理的B16-F10细胞24小时的活力测定。Cas9-NC质粒中的sgRNA被无序DNA取代。(F)在N/P分别为2、5、10、15、20和30时，PBS、Cas9-PD-L1和Vector/Cas9-PD-L1转染B16-F10细胞后的代表性流式细胞仪图和(G)相对平均荧光强度。

接下来，研究团队探索了Au CSTDs靶向传递的细胞内机制。细胞吞噬实验表明，PBA可以靶向肿瘤表面的唾液酸，并且细胞对复合物的摄取量随时间延长而增多（图4A）。溶酶体逃逸实验表明，加入复合物两小时后材料进入细胞，四小时后基因可进入溶酶体，八小时后基因从溶酶体出来，并有进入细胞核的趋势（图4B和C）。针对含金、响应、靶向三种特性，团队构建对照材料后进行了绿色荧光转染实验，结果显示双响应的Au CSTDs/Cas9-PD-L1系统由于肿瘤细胞的特异性摄取、响应性基因释放和强烈的内体逃逸，展现出更高的基因转染效率。

图4. (A) B16-F10细胞对Vector/Cas9-PD-L1在不同时间的细胞摄取。PBA作为阻断剂：加入Vector/Cas9-PD-L1前10分钟，用游离的PBA（4 mM）处理B16-F10细胞。(B)用Cy3标记的Cas9-PD-L1与Au CSTDs复合后处理2、4和8小时时，B16-F10细胞的共聚焦显微图像和相应的共定位荧光强度剖面分析以及(C) Cy3（红色荧光）和溶酶体（绿色荧光）之间的共定位率。细胞核用Hoechst 33342染色。溶酶体用LysoTracker绿色染色。比例尺:20 μm。PBS、nCSTD（非靶向非响应）、PBA + Au CSTDs（非靶向有响应）、Au CSTDs（有靶向有响应）和CSTD（不含纳米金颗粒）分别压缩Cas9-PD-L1质粒后，与B16-F10细胞孵育4 h后的(D)相对平均荧光强度与(E)荧光图像。PBA作为阻断剂。比例尺：100 μm。

研究团队进一步验证了Au CSTDs递送CRISPR-Cas9系统的作用机制。T7核酸内切酶I证实了该系统有效的基因编辑能力，它可以在DNA水平上显著降低PD-L1基因。值得注意的是，用Au CSTDs作为载体递送系统，比游离Cas9-PD-L1的对照组基因编辑效率增加了7.1倍（图5A）。RT-PCR以及WB实验证明，CRISPR-Cas9系统可以进一步降低PD-L1基因的RNA水平以及蛋白质水平（图5B和C）。

图5. (A) PD-L1基因组位点的T7EI检测，(B) PD-L1基因表达的RT-PCR检测，(C) PBS、Cas9-PD-L1、Vector/Cas9-PD-L1和Vector /Cas9-NC转染后PD-L1蛋白表达的WB检测。在(B)和(C)中，PBS处理的细胞表达量设为1.0。

考虑到Au纳米颗粒具有良好的X射线衰减特性，研究团队对Au CSTDs的CT成像性能进行评价。与临床造影剂碘海醇相比，Au CSTDs具有更好的X-线衰减能力（图6A）。随后，研究团队建立了B16-F10肿瘤模型研究Au CSTDs在体内的积累和分布。结果显示，注射材料1小时后，Au在肿瘤及各器官中的含量达到峰值，随后逐渐被代谢出体外（图6B-D）。

图6. (A)不同浓度的Au CSTDs和碘海醇中Au或I的的CT图像和HU值。(B) B16-F10肿瘤模型瘤周注射Au CSTDs（[Au] = 5 mM）后，不同时间间隔的CT图像和HU值。肿瘤区域用红色圈出。(D)瘤周注射Au CSTDs后，小鼠主要器官和肿瘤在不同时间的Au含量的生物分布。

团队研究评价了Au CSTDs/Cas9-PD-L1对B16-F10荷瘤小鼠的ICB治疗效果。经过治疗，相对于PBS组和载体/Cas9-NC组，Anti-PD-L1组和载体/Cas9-PD-L1组的肿瘤生长受到了一定的抑制，且载体/Cas9-PD-L1的抗肿瘤效果最好，且组间的小鼠体重变化较小（图7A-D）。HE、TUNEL和ki-67染色结果显示，治疗组可以促进肿瘤组织的坏死和凋亡，并且抑制肿瘤细胞的生长（图7E和F）。

图7. (A)体内肿瘤免疫治疗的示意图及时间轴。小鼠的(B)相对肿瘤体积变化、(C)分离肿瘤的照片和重量以及(D)不同治疗组的体重变化。每组6只小鼠。(E)第12天B16-F10肿瘤组织的H&E、TUNEL和Ki-67染色图片。比例尺：50 μm。(F)肿瘤切片中TUNEL阳性细胞和Ki-67阳性细胞的百分比。

最后，团队探究了载体/Cas9-PD-L1抑制肿瘤的机制。WB实验和免疫荧光图片显示出，载体/Cas9-PD-L1组以及Anti-PD-L1组肿瘤部位PD-L1蛋白的表达显著下降，以及浸润的CD4⁺和CD8⁺ T细胞的增加（图8A和B）。并且，两组均可引起脾脏部位CD4⁺和CD8⁺ T细胞的表达增加、Tregs细胞的表达下降（图8C-F）以及血清中细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的分泌上升（图8G-I所示）。

图8. (A)肿瘤组织中PD-L1蛋白表达的图像和定量分析。PBS处理的肿瘤组织中PD-L1的表达设置为1.0。(B)肿瘤组织中PD-L1蛋白、CD4和CD8 T细胞的免疫荧光染色。比例尺：50 μm。脾脏中T细胞的流式细胞术分析。(C) CD4⁺/CD8⁺ T细胞和CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺ T细胞（Tregs）的点图。(D) CD4⁺和(E) CD8⁺ T细胞的比例和(F) Tregs的比例。(G)第12天血清中TNF- α、(H) IFN-γ和(I) IL-6的定量分析。

简言之，研究团队设计的pH和H₂O₂敏感的Au CSTD纳米材料可以压缩和响应性释放CRISPR/Cas9质粒，通过永久性和特异性地破坏肿瘤细胞中PD-L1的表达，实现ICB治疗。Au CSTDs/Cas9-PD-L1通过靶向过表达唾液酸被肿瘤细胞特异性摄取，随着苯硼酸酯键的断裂Cas9-PD-L1被响应性释放出来，并定位于细胞核有效地切割PD-L1基因。体内实验证明，Au CSTDs/Cas9-PD-L1系统可以特异性聚集于肿瘤实现增强的CT成像，显著降低肿瘤细胞的PD-L1表达、诱导CD4⁺/CD8⁺ T细胞分布增加、减少免疫抑制细胞比例、上调细胞因子TNF-α/IFN-γ/IL-6，表现出显著的肿瘤抑制效果。因此，本研究制备的Au CSTD纳米材料为递送CRISPR/Cas9质粒用于ICB治疗提供了新的思路。

以上研究成果以“Dual-Responsive Core?Shell Tecto Dendrimers Enable Efficient Gene Editing of Cancer Cells to Boost Immune Checkpoint Blockade Therapy”为题，发表于国际著名期刊ACS Applied Materials & Interfaces（2023, 15, 12809-12821）。东华大学生物与医学工程学院郭睿教授和史向阳教授为通讯作者，硕士研究生刘俊洁为第一作者。该工作得到了国家自然科学基金、上海市人才发展基金、上海市科学技术委员会等项目的资助。

文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.2c22584

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（责任编辑：xu）

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