免疫治疗逐渐成为应对恶性肿瘤的一大重要手段，其通过激活机体免疫系统，识别并杀死特定的肿瘤细胞，产生免疫记忆效应，具有更为持久的疗效，包括免疫检查点阻断、嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（CAR-T）、T细胞受体工程化T细胞疗法（TCR-T）等在内的免疫疗法已取得巨大成功。近年来，肿瘤疫苗作为免疫疗法的新兴成员，引发了广泛关注。然而，目前传统肿瘤疫苗存在抗原/佐剂包载效率低、淋巴结回流能力较差、体内利用率低和功能单一化等缺点，疗效不佳。

  随着纳米技术的快速发展，基于各类生物材料的纳米载体已经成为肿瘤治疗的强大平台，将纳米载体应用于肿瘤疫苗的开发有望为上述问题提供解决方案。一般来说，纳米材料可以通过静电相互作用、疏水相互作用以及共价结合等多种方式实现对抗原和佐剂的高效包载。同时，纳米载体易于多功能化，有助于实现不同治疗方式与免疫治疗的联合，克服单一肿瘤治疗模式存在的缺点。

  光热治疗（PTT）通过加热消融肿瘤产生肿瘤抗原以及其他免疫信号来激活抗肿瘤免疫反应。纳米硫化铜（CuS）以其制备简单、成本低及表面等离子体共振吸收引起的光热性能等特性受到了较多的关注。树状大分子具有高度支化、结构稳定可控、表面高官能化、低细胞毒性、无免疫原性等优势，是优良的载体基材。其中，聚酰胺-胺（PAMAM）树状大分子因其表面富含大量氨基，可与带负电荷的抗原及免疫佐剂产生良好相互作用，在构建肿瘤疫苗上具有潜力。与此同时，在其表面修饰苯硼酸（PBA）可与不同类型的蛋白质具有高结合亲和力，形成稳定的复合物，实现良好的胞内传递效率。

  在研究团队早期工作中，已经证明两性离子修饰的PAMAM树状大分子可用于模板合成CuS纳米颗粒，具有良好的光热转换效率，用于肿瘤的化疗/光热治疗（Small Methods 2021, 5, 2100204）和光热/基因治疗（ACS Appl. Mater. Interfaces 2021, 13, 6069-6080）。基于此，他们假设，构建表面修饰PBA分子、内部包裹硫化铜纳米颗粒的第五代PAMAM树状大分子与STING激动剂cGAMP的复合物，不仅可以通过PTT触发肿瘤免疫原性死亡并释放肿瘤抗原，还可以通过捕获原位生成的肿瘤抗原，进而形成纳米疫苗，实现PTT/免疫联合治疗。

  研究团队首先通过Uv-vis、TEM和光热转换性能测试证明了G5-PBA@CuS的成功合成，并具有良好的光热转换能力（图2a-e）。通过与BSA进行蛋白吸附实验，根据吸附前后吸光度差值可以得到经PBA修饰的材料能够很好地吸附蛋白（图2f）。该研究以小鼠黑色素瘤（B16-F10）为模型进行了体外、体内研究，在细胞毒性实验中，未经激光照射的细胞均保持较高的细胞活力，说明G5-PBA@CuS具有良好的细胞相容性；激光照射后，随着Cu浓度的增加，细胞活力逐渐降低，表明G5-PBA@CuS对B16-F10细胞具有良好的光热消融效果（图2g）。细胞吞噬结果表明，G5-PBA@CuS能更好的被B16-F10细胞所吞噬（图2h）。通过BCA检测抗原吸附量表明G5-PBA@CuS具有优异的抗原捕获能力（图2i），从而为纳米疫苗的构建提供便利。

 图2.（a）不同浓度的G5-PBA@CuS的UV-vis光谱图；G5-PBA@CuS（b）TEM图片和（c）粒径分布直方图；（d）水和不同浓度的G5-PBA@CuS水溶液的光热升温曲线和（e）单个升降温循环曲线图；（f）不同浓度的G5-PBA@CuS和G5-NHAc@CuS与BSA孵育离心前后吸光度变化；（g）不同处理后B16-F10细胞CCK-8活力测试；（h）不同处理后B16-F10细胞对材料摄取情况；（i）BCA检测不同浓度的材料处理癌细胞后的抗原吸附量。

图3. 各组材料与B16-F10细胞共孵育后，（a）CRT的表达，（b）ATP的分泌，（c）HMGB-1的释放情况分析图；（d-e）各组材料刺激DCs熟化的分析图；（f-g）不同处理后DCs上MHC-II表达的分析图；（h）不同处理后DCs释放IFN-β量。对于（a-h）：Ⅰ，PBS；Ⅱ，G5-PBA@CuS；Ⅲ，G5-PBA@CuS/cGAMP；Ⅳ，G5-PBA@CuS + Laser；V，G5-PBA@CuS/cGAMP + Laser ([Cu] = 0.8 mM， [cGAMP] = 1 μg/mL)。

图4. （a）小鼠体内治疗过程示意图；（b-c）治疗14天内小鼠体重及肿瘤体积变化曲线；（d）不同治疗后的小鼠生存曲线图；（e）治疗第14天肿瘤切片的TUNEL、Ki-67和CRT染色结果。（f-h）CD4+、CD8+T细胞和Tregs的流式定量图。对于（b-h）：Ⅰ，PBS；Ⅱ，G5-PBA@CuS；Ⅲ，G5-PBA@CuS/cGAMP；Ⅳ，G5-PBA@CuS + Laser；V，G5-PBA@CuS/cGAMP + Laser。

图5. （a）小鼠体内治疗过程示意图；（b-c）治疗14天内小鼠体重及远端瘤体积变化曲线；（d）治疗第14天远端瘤切片的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞染色结果；（e-g）CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和Tregs的流式定量图。

图6. （a）荷瘤小鼠体内治疗过程示意图；（b-c）治疗期间小鼠体重及肿瘤体积变化曲线；（d）不同治疗后的小鼠照片；（e-f）肿瘤部位CD4+、CD8+ T和Tregs细胞的流式分析；（g-i）CD4+、CD8+T细胞和Tregs的流式定量图。

图7. （a）小鼠体内治疗过程示意图；（b-c）治疗期间小鼠体重及肿瘤体积变化曲线；（d）不同治疗后的小鼠照片；（e-f）脾脏部位CD4+、CD8+ T细胞和Tregs的流式分析；（g-i）CD4+、CD8+T细胞和Tregs的流式定量图。

  简言之，该研究设计的G5-PBA@CuS/cGAMP纳米颗粒具有以下优势：1）所构建的纳米颗粒具有优异的光热转换效率和蛋白质吸附特性，并可与STING激活剂cGAMP复合后用于肿瘤的光热/免疫治疗，从而诱导免疫原性死亡，激活免疫系统；2）在激光照射后，G5-PBA@CuS/cGAMP复合物可有效联合PTT/免疫治疗抑制原发肿瘤，同时通过修饰的PBA分子捕获原发肿瘤抗原，形成原位疫苗，产生适应性免疫反应，从而有效抑制远端肿瘤的生长；3）在体外制备得到的G5-PBA@CuS/antigen/cGAMP复合物可作为预制纳米疫苗，对原发肿瘤进行免疫治疗，并通过所产生的免疫记忆效应来预防肿瘤的发生。本研究制备的G5-PBA@CuS/cGAMP纳米颗粒为构建纳米疫苗提供了新的思路。

  文章链接：https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2023.01.076