1．引言
细胞功能通常是由生物分子之间的弱相互作用即非共价作用而引起的，如酶与底物、蛋白质与配体、蛋白质与蛋白质及抗原抗体反应。对这些弱相互作用的影响会导致疾病的发生。如ras-GDP(蛋白质-配体)，γ-干扰素（蛋白质-蛋白质同源二聚体），FKBP-rapamycin（蛋白质-抑制剂复合物）。生物学家们对这些作用正进行广泛的研究以便更好地了解人体是怎样起作用的及细胞功能失常是由什么原因引起的，更重要的是如何最有效地预防这些正常过程的改变而导致的疾病。
常规用于检测非共价复合物的方法如凝胶色谱、超速离心、红外光谱、差示紫外光谱、荧光光谱、园二色谱、X-晶体衍射及核磁共振等。但各有各的优缺点。凝胶色谱、超速离心、红外光谱、差示紫外光谱、荧光光谱、园二色谱等只能表明形成复合物后蛋白质的结构发生了变化，但提供很少或不能提供关于分子量及复合物化学计量结合数的信息。X-晶体衍射和核磁共振方法被用于测定蛋白质的三维结构，可以提供详细的结构信息。但都很费时和复杂。X-晶体衍射只有在得到合适晶体的情况下才能应用，但单晶的培养是很不容易的。核磁共振分析所用样品量很大且不能分析分子量很大的复合物（大于40KD）。随着近年来软电离技术的发展，质谱技术在蛋白质非共价复合物研究方面显示了一定的威力。
由于ESI是一项软电离技术，因此很少使分子裂解产生碎片，因此非共价复合物能够用ESI来研究。它能够在非常接近天然溶液状态的情况下研究复合物，能够更加真实地反映生物大分子的生理状态。到目前为止，用ESI观察到的不同的复合物包括蛋白质-蛋白质（1,2），蛋白质-配体（3~5），蛋白质-寡核苷酸（6,7）和蛋白质-双链DNA（8）及蛋白质-金属离子复合物（9~11）。可见，ESI-MS已广泛用于研究蛋白质非共价键复合物。由于其具有灵敏度高、快速和质量精确度高的优点，结合物的化学计量比能够很容易地从分子量推导出。通过改变Cone电压、改变pH值和毛细管温度，可以比较不同化合物与蛋白质的亲合力的大小（12）。通过与部分酶解和完全酶解相结合，还可以确定小分子与蛋白质的结合位点（13）。总之，应用ESI 研究蛋白质复合物能够在样品用量少（皮克摩尔到亚皮克摩尔），快速的情况下得到可靠的数据和较多的信息。
基于ESI的许多优点，美国一实验室已致力于发展质谱方法来研究生物大分子非共价复合物，以便寻找一种抗癌剂。他们的策略是从合成的或天然的资源中筛选能够与致病蛋白非共价键结合的抑制剂，以便来干预致病机理（12）。该实验室自1990年开始该项目以来，已用ESI研究了ras-蛋白和其配体GDP(14)和GTP（15）的非共价相互作用。在最近的工作中，他们用ESI检测到了ras-GDP和有机抑制剂SCH54292和SCH54341的三元复合物，在三元复合物ras-GDP-SCH54292的研究中，他们还确定了药物和ras蛋白的结合位点。从上述研究可以看出，ESI-MS作为研究蛋白质非共价键复合物的工具，具有很好的应用前景。
2．电喷雾质谱(ESI-MS)的基本原理
ESI是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面积缩小，导致分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生多电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比降低到多数质量分析仪都可以检测的范围，因而大大扩张了分子量的分析范围。离子的真实分子量可以根据质荷比及所带电荷数计算出，一般由计算机软件完成。电喷雾质谱可忍受少量的盐和缓冲液，但盐和缓冲液的存在会使仪器的灵敏度降低。电喷雾质谱的优点是它可以方便地与多种分离技术联用，如液质联用和毛细管电泳-质谱联用等。
3．电喷雾质谱(ESI-MS)研究蛋白质非共价复合物的实验条件
电喷雾质谱研究蛋白质非共价键复合物成功的关键条件是很好的理解和调节仪器参数和样品制备。一般情况下用电喷雾质谱研究蛋白质或多肽的最灵敏和最稳定条件并不适用于蛋白质非共价键复合物的研究。通常，用电喷雾质谱研究蛋白质时，样品溶于含1%HCOOH 或1%HOAc的含一定比例乙腈或甲醇的水溶液中。这样的条件对蛋白质形成非共价键复合物是不利的，会破坏非共价键的形成。在接近生理pH时，蛋白质保持有天然的活性构象，才能形成非共价键复合物。因此，研究蛋白质非共价键复合物时，样品常溶于2-50mM NH4Oac或NH4HCO3中，pH在5-8之间比较合适。毛细管温度或电喷雾源温的高低对蛋白质非共价键复合物也有影响。在能够使样品离子化的条件下，温度越低越好。电喷雾大气压和真空之间的电压或Cone电压对复合物也有很大的影响，电压高时会导致复合物的解离。总之，所有能够导致蛋白质变性的因素都不利于蛋白质非共价键复合物的形成。PH值、有机溶剂、温度和电压是在研究蛋白质非共价键复合物时要考虑的几个重要因素。用电喷雾质谱研究蛋白质非共价键复合物的稳定性也常常是通过改变这几个条件来实现的。
4．电喷雾质谱(ESI-MS)在蛋白质非共价复合物研究中的应用事例
自1991年Ganem（） 等最早应用电喷雾质谱研究蛋白质FKBP12 和其配体FK506 和rapamycin 的非共价键复合物以来，该技术就被越来越多的学者所应用。Smith 和Zhang（）、Loo()及Pramnik等（）相继发表了很好有不同侧重点的综述。本人仅举几个典型事例来说明电喷雾质谱在蛋白质非共价键复合物中的广泛应用及其优越性。
A. 蛋白质-蛋白质相互作用
电喷雾质谱在研究蛋白质四级结构方面显示出了巨大的能力。蛋白质复合物有同源和异源两种。质谱根据质量的差别可以区分这两种复合物。Brookhaven protein databank Brookhaven 蛋白质数据库的所有蛋白质中，33%的形成了多聚体复合物（a1）。在这些复合物中，80%的形成了二聚体或四聚体。电喷雾质谱非常适用于鉴定蛋白质的亚基数目。
Loo(a2)等报道了HIV整合酶突变体IN F185K同源二聚体的电喷雾质谱研究。HIV整合酶在HIV病毒复制过程中起非常重要的作用，有可能成为一个新的抗爱滋病药物的靶点(a3)。由于HIV整合酶的溶解度很小，因此不易搞清它的构象。IN F185K是它的一个突变体，溶解度增大，但不影响其活性。研究表明，HIV整合酶以二聚体的形式起作用，与晶体结构是一致的（a4-6）。在pH2.5的溶液中（乙腈：水=2:1v/v, 含3%乙酸），IN F185KIN F185K的电喷雾质谱图是单体的多电荷峰，所带电荷从+12到+22，共11个多电荷峰。转换后的分子量为18172.0。在酸性及有有机溶剂乙腈存在的条件下，IN F185K彻底变性，使蛋白中所有缄性氨基酸都暴露出来带上质子，因此形成了最高带+22个电荷的11个多电荷峰。在pH6.5的10mM的乙酸氨溶液中，IN F185K的电喷雾质谱图是二聚体的多电荷峰，在m/z3000左右形成了三个多电荷峰，最高所带电荷为+13。转换后的分子量为36345.9。在pH6.5的10mM的乙酸氨溶液中，IN F185K保持有天然的活性构象，形成结构紧密的二聚体，只有暴露在分子表面的部分缄性氨基酸才能够带上质子，因此仅有三个多电荷峰。增加IN F185K的浓度，并没有观察到其它非特异性的多聚体。将大气压和真空接口的电压从50 增加到140，二聚体则降解为单体。
B. 蛋白质和配体
Schwartz(b1)等用电喷雾质谱研究了两个小分子配体生物素（分子量244）和亚氨基生物素（分子量243）和一个由四个亚基组成的大蛋白链亲和素核心core streptavidin （分子量53084）的非共价键结合行为。链亲和素Streptavidin 和亲和素一样，与生物素由很特异、很强的亲和力（Kd=10-15M）,这使得这一类非共价键复合物在生物化学和分子生物学，尤其是免疫化学和亲和分离中的应用非常的广泛（b2-5）。而和亚胺生物素的亲和力很弱（Kd=10-7M）。将配体和链亲和素核心溶解于pH8.6 10mM的乙酸氨溶液中，配体和蛋白 链亲和素核心core streptavidin的摩尔浓度比为7:1。在相同的实验条件下进行电喷雾质谱分析，结果表明，与已知的溶液中的结果一致，生物素和链亲和素核心四聚体形成了4:1的非共价键复合物，而亚胺生物素和链亲和素核心没有形成复合物。只有在仪器界面条件极为温和，配体浓度更高和孵育时间更长时才有部分亚胺生物素和链亲和素核心结合，但结合并不完全。作者用热诱导裂解还研究了配体和链亲和素核心非共价键复合物的稳定性，毛细管温度升高时，复合物裂解，部分蛋白质四聚体也解离为单体。作者还用负离子电喷雾质谱研究了生物素化的寡核苷酸和链亲和素核心的非共价键结合。与溶液中的行为一致，寡核苷酸和链亲和素核心化学结合计量比为4:1。该实验结果表明，用电喷雾质谱研究大分子蛋白和小分子配体相互作用的结果和溶液中的行为是一致的，且灵敏、准确、快速，有很好的应用前景。
C. 酶和抑制剂
HIV-1蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶家族的一个成员。该家族成员包括木瓜酶、肾素、凝乳酶及组织蛋白酶D等(c1)。HIV蛋白酶专一性地催化病毒 gag和gag-pol转录产物，产生装配病毒颗粒所需要的酶和结构蛋白质。HIV-1蛋白酶活性在pH6时最高，将二聚体解离会导致酶活性的完全散失。胃蛋白酶抑制剂A（ isovaleryl-Val-Val-Sta-Ala-Sta, Mr686）是天冬氨酸蛋白酶的特异性抑制剂(c2-3)。HIV-1蛋白酶的活性位点有两个亚基的相同部分组成。抑制剂和酶的反应有氢键和疏水作用共同起作用。
Loo(a2)等用电喷雾质谱研究了胃蛋白酶抑制剂A和HIV-1蛋白酶的结合与pH值的关系。在pH2.5的2.5% 乙酸溶液（乙腈：水=2：1）中，只有HIV-1蛋白酶单体的多电荷峰。最高所带电荷数为13，共6个多电荷峰。将胃蛋白酶抑制剂A和HIV-1蛋白酶的乙酸氨储备液混合后，用乙酸或氨水调节溶液的pH值并测定其电喷雾质谱图。在pH4.7-6.9的溶液中观察到了胃蛋白酶抑制剂A和HIV-1蛋白酶二聚体的三元复合物，同时有HIV-1蛋白酶二聚体和单体的存在。酶与抑制剂的三元复合物在 pH5.5-6.0时最稳定。该结果与以前Baca and Kent(c4) 报道的结果一致。酶与抑制剂的三元复合物对电喷雾质谱的大气压真空接口条件很敏感，在低的 Vts(10V)和低毛细管温度时（175）三元复合物的丰度最高。提高毛细管温度会使三元复合物降解。
D. 抗原-抗体反应
用电喷雾质谱研究抗原抗体相互作用不仅灵敏、准确、快速，与酶解相结合还可以确定抗原表位及抗体互补位。MILLAR(d1) 等用电喷雾质谱直接检测到了一个新的能够抑制HIV-I活性的有17个氨基酸组成的微抗体（ MicroAb）和代表从巴西（clade B）和非洲(clade A)分离出的第一代 HIV-1菌株V3区的肽(V3肽)的相互作用。该微抗体（ MicroAb）是一个能特异性地与HIV-1包膜糖蛋白gp120V3 环状区作用的鼠单抗IGGI(F58)的重链第三补体区（CDR-H3）的一部分(d2)。它的活性比F58的高5倍。将MicroAb和V3肽溶解于pH7.0的50mM的乙酸氨溶液中，使浓度分别为500ug/ml，37℃反应1小时后进行电喷雾质谱测定。观察到了MicroAb和V3肽的复合物。但同时存在未结合MicroAb和V3肽，且复合物的丰度相对较低。可能是所用的载液（乙腈：水=1：1，含0.1%甲酸）不大合适，不利于复合物的形成。结果表明MicroAb是通过与病毒颗粒直接结合而介导病毒失活的。
将V3肽用胰蛋白酶进行完全酶解（37℃ 1小时）和部分酶解（4℃ 2分钟）。然后将酶解肽段和MicroAb混合后在37℃反应1小时后进行电喷雾质谱测定。结果表明只有部分肽段与MicroAb结合。通过比较与MicroAb结合肽段的序列及进一步研究，证明MicroAb的抗原表位是RKSIXIGPGR。
该实验结果说明用电喷雾质谱研究溶液中抗原-抗体反应是灵敏、快速、准确的方法。
E. 蛋白质和寡核苷酸
蛋白质和DNA的相互作用涉及到细胞过程的许多方面，因此具有重要的意义。化学结合计量是蛋白质和DNA相互作用的一个重要特性。当一个样品中含有不同的化学结合计量数或结合后分子量差别很小时，化学结合计量的测定就更为困难(e1)。电喷雾质谱由于具有高灵敏度和高质量准确度的优点，因此可以很准确的测定其化学结合计量。
Cheng(e2)等用电喷雾质谱研究了从细菌噬菌体分离的geneV蛋白和几个寡核苷酸的化学结合计量数。在噬菌体的复制过程中Gene V 蛋白起稳定单链DNA(ssDNA)的作用，并将合成的噬菌体DNA从双链转变为单链。已知geneV蛋白在生理条件下主要以二聚体存在，Kd~-12 M。在pH7.0 10mM乙酸氨溶液中，无论是正离子还是负离子电喷雾质谱，geneV蛋白都主要以二聚体存在。在负离子条件下，形成了最高所带电荷为-8的四个多电荷峰。在pH3.0 50mM乙酸溶液中，形成了最高带+14电荷的11个多电荷峰。这与酸致蛋白质变性的结果一致。
将不同浓度比的geneV蛋白和16mer的寡核苷酸在pH7.0 10-50mM的乙酸氨中反应10分钟后进行电喷雾质谱分析，结果表明gene V蛋白和16mer 寡核苷酸可以形成不同化学结合计量的非共价键复合物。主要是4:1(gene V :16mer I), 当寡核苷酸过量时，有少量2:1的复合物存在。
作者同时用电喷雾质谱研究了gene V蛋白和 d (pT)13 、d (pT)15、 d (pT)18三个同源寡核苷酸的化学计量结合数。当gene V蛋白的摩尔浓度和 d (pT)13 、d (pT)15、 d (pT)18混合物的总摩尔浓度比为1:1 时， d (pT)18 主要形成4:1的复合物，而d (pT)13 和d (pT)15主要形成2:1的复合物。当gene V蛋白的摩尔浓度和 d (pT)13 、d (pT)15、 d (pT)18混合物的总摩尔浓度比为2:1时，d (pT)18 和d (pT)15形成4:1的复合物，而d (pT)13仍形成2:1的复合物。说明gene V蛋白和d (pT)13的主要化学结合计量数为2:1，和d (pT)18的为4:1,而和d (pT)15的化学结合计量数则根据寡核苷酸和gene V蛋白的相对浓度不同为4:1或2:1。
有文献报道gene V蛋白与poly(dA)和poly(dT)的亲和力相差两个数量级。作者用电喷雾质谱也得到了相同的结论。将gene V蛋白和d (pT)13 、d (pA)14的混合物
在pH 7.0 10mM乙酸氨溶液中进行电喷雾质谱分析。当d (pT)13和d (pA)14摩尔浓度相同时，主要是gene V蛋白和d (pT)13 形成的2:1的非共价键复合物。几乎没有gene V蛋白和d (pA)14形成的复合物。当只有d (pA)14 时，gene V蛋白和d (pA)14可以很容易形成2:1的复合物。当d (pT)13和d (pA)14摩尔浓度为2:100时，gene V蛋白和d (pT)13 形成的2:1复合物的丰度是gene V蛋白和d (pA)14形成的2:1复合物的8倍。和浓度一起考虑，则gene V蛋白和d (pT)13的亲和力是和d (pA)14亲和力的400倍。
可见，电喷雾质谱在研究蛋白质和DNA 相互作用时有巨大的优越性。
F. 金属离子和肽
金属离子在许多生物过程都起着非常重要的作用。它们通过触发机理、稳定结构及控制氧化还原反应来起作用。在所有的二价金属离子中，钙离子的作用最为重要。借助于细胞膜内外的浓度差，钙离子在调节细胞过程中常充当第二信使的作用。其调节细胞的过程常涉及钙结合蛋白质（f1-5）。Veenstra(f6)等用电喷雾质谱研究了钙调蛋白和两个肽的非共价键复合物。一个肽是钙调素依赖的蛋白酶II的钙调素结合区，一个是毒蜂肽。只有在钙离子存在时，钙调素和两个肽及钙离子形成1:1:4(钙调素：肽：钙离子)的三元复合物。同时他们还证明三元复合物的稳定性与电喷雾质谱的源温有关。 Nemirovskiy (f7)等用串联质谱（FAB和ESI）研究了以兔肌钙蛋白的钙离子结合位元点III为模型的一系列小肽和钙离子复合物的高能和低能碰撞活化裂解行为。电喷雾质谱中产生的钙离子/肽段碎片有钙离子结合控制，提供了钙离子结合位点的信息。表明钙离子结合位点涉及到一个天冬氨酸、一个谷氨酸和一个谷氨酰氨。快原子轰击质谱中产生的肽段十分复杂，不易解析。
Hu and Loo(f8)用电喷雾质谱研究了小白蛋白和钙调素与钙离子的化学结合计量数及其协同关系。研究发现小白蛋白的两个钙离子结合位点与钙离子的结合有很强的协同性。在钙离子浓度高时，钙调素可以和四个钙离子结合。第三个钙离子和第四个钙离子与钙调素的结合有很强的协同性。钙调素分子中与钙离子结合的两部分也有很强的相互作用。
5．结论
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