为了实现预防、诊断、治疗等药效功能，生物大分子药物往往需要穿透细胞膜进入胞内。因此，生物药物胞内递送是生物药物面临的一个关键问题。由于光介导的胞内递送方法具有较好的通用性和调控性，适用于各类细胞和各种生物药物的递送，尤其是在体外或离体处理的情况，因此受到了越来越多的关注。

  黄超伯/熊燃华课题组长期致力于功能性生物大分子胞内递送研究，利用光热纳米颗粒（NPs）富集于细胞表面进行光穿孔，光热NPs产生的瞬时光热效应可以将功能性生物大分子温和地递送至活细胞中，适用于多种细胞类型和生物大分子。然而，该光穿孔技术依赖于细胞与光热NPs的直接接触，这在临床应用中，特别是在癌症患者自体免疫T细胞功能化改造过程中，面临安全性和监管的诸多挑战。为此，研究团队创新性地提出了一种基于光热静电纺纳米纤维（PEN）介导的光穿孔技术。该技术通过将光热NPs嵌入静电纺纳米纤维中，作为细胞培养的基底，利用光热效应诱导细胞膜透化，进而有效递送生物大分子至各种细胞类型。与传统方法相比，该技术避免了细胞与NPs的直接接触，从而显著降低了安全性和监管风险。与常用的物理转染方法——电穿孔相比，PEN光穿孔对细胞的损伤更小，能够获得更高质量的工程化改造细胞，展现出更强的临床治疗潜力（Nat. Nanotechnol. 2021, 16, 1281、Adv. Mater. 2021, 33, 2008379、Nat. Commun. 2022, 13, 1996）。

图1. PEN光穿孔用于胞内递送的详细步骤。（1）静电纺丝制备包载光热纳米颗粒的PEN纳米纤维基底。（2）PEN基底和细胞共培养。（3）PEN光穿孔激光辐射平台。（4）利用模型大分子优化PEN光穿孔参数。（5）采用优化的PEN光穿孔方案，将功能大分子递送至各种类型细胞。（6）体外和体内验证PEN光穿孔工程化改造CAR-T细胞的治疗效果。

图2. PEN 光穿孔参数优化用于 HeLa贴壁细胞和 Jurkat 悬浮细胞的递送。（a）在有和无胶原涂层的 PEN 基底上生长的 Calcein AM 标记的 HeLa 细胞的共聚焦图像。（b）HeLa 细胞在不同激光能量和光热NPs 浓度下的 RD10递送效率和细胞活性。（c）深红色荧光 CellMask 标记的 Jurkat 细胞在香豆素6标记的 PEN基底上的共聚焦图像。（d）Jurkat 细胞在不同激光能量、光热NPs 浓度、和重复激光照射下的FD10递送效率和细胞活性。

图3. PEN 光穿孔应用于功能大分子siRNA或CRISPR-Cas9 RNPs的胞内递送研究。（a）共聚焦显微镜显示了使用 1 wt% 光热NPs 和 0.08 J cm^?2 激光能量进行 PEN 光穿孔处理的对照组和 siGFP胞内递送的 H1299 细胞eGFP 的表达。（b,c）不同 siGFP 浓度或在低浓度 0.5 μM siGFP下重复 PEN 光孔化处理时，H1299 细胞eGFP 表达的 MFI 和 eGFP 敲低效率。（d）共聚焦显微镜显示了光穿孔将CRISPR-Cas9 RNPs递送到H1299细胞以敲除GFP表达。（e,f）不同 RNP 浓度或在低浓度 0.5 μM RNP下重复 PEN 光孔化处理时，H1299 细胞eGFP 表达的 MFI 和 eGFP 敲除效率。

图4. PEN光穿孔用于人T细胞高效安全的生物大分子胞内递送及其肿瘤细胞杀伤功能。（a）PEN光穿孔方法递送小干扰核酸siPD1到T细胞以抑制PD1蛋白表达。（b）使用优化的 PEN 光孔化参数（5 wt% 光热NP浓度，0.16 J cm^?2 激光能量和 NaOH 水解的 PENs）时，siPD1 浓度变化对人类 T 细胞中 PD1 敲低效率的影响。（c）静脉注射CAR-T细胞(阴性对照)、PEN光穿孔处理的CAR T 细胞（携带 siPD1，实验组）和与PD1 抗体联合使用的 CAR T 细胞（阳性对照）的肿瘤大小随时间变化。

  论文链接：https://doi.org/10.1038/s41596-024-01115-7

  实验室主页：https://www.x-mol.com/groups/nfu-ugent