重庆大学蔡开勇/冯茜 Adv. Mater.：一石二鸟策略修复椎间盘髓核
椎间盘退变（IVDD）的病理生理过程极其复杂，包括NP细胞凋亡、细胞外基质（ECM）恶化、各种炎性细胞因子的释放、纤维环破裂，继而椎间盘高度和运动性下降。同时，在IVDD过程中，IVD信号转导的紊乱和活性氧（ROS）的积累会进一步促进NP细胞凋亡，从而加重IVDD。大量临床研究表明，ECM中ROS的水平与IVDD的严重程度密切相关。ROS的过度积累会诱发过度的氧化应激和NP损伤，最终导致IVD基质的完整性受损。
鉴于此，重庆大学蔡开勇教授/冯茜副教授和华中科技大学李锋教授等人设计了一种由HA-NCSN和Cu2+构成的水凝胶，其在低度Cu2+浓度下表现出快速凝胶化、方便的注射和自愈特性以及出色的抗氧化能力。值得注意的是凝胶化过程中Cu2+被迅速还原，水凝胶颜色变黑且表现出高效的光热性能。一方面，HA-NCSN/Cu水凝胶在抑制TNFα介导的炎症和氧化应激方面表现出显着的功效，由于其ROS清除能力而增强了NP细胞的活性。另一方面，RNA测序（RNA-seq）分析表明，轻度PTT可以激活NP细胞的TGF-β/Smad通路，SMAD2/3的磷酸化证明了这一点，从而进一步促进ACAN和COL2的表达和分泌，这两者都是髓核细胞外基质的主要成分。
该研究成果于近日以“A One-Stone-Two–Birds Strategy for Intervertebral Disc Repair: Constructing a Reductive Chelation Hydrogel to Mitigate Oxidative Stress and Promote Disc Matrix Reconstruction”为题发表在Advanced Materials。重庆大学生物工程学院蔡开勇教授/冯茜副教授，华中科技大学同济医院李峰教授，卡托维兹西里西亚大学Serda, Maciej教授为通讯作者。重庆大学硕士研究生卜鹏真，华中科技大学博士研究生彭仁鹏，南方医科大学张家明副研究员为论文的共同第一作者。
方案1展示了HA-NCSN/Cu 水凝胶通过抗氧化和光热疗法修复IVDD。HA-NCSN与Cu2+交联形成水凝胶。将HA-NCSN/Cu水凝胶注入髓核，消除过量的ROS，从而保护NP细胞免受氧化应激。同时，光热激活刺激NP细胞的TGF-/Smad通路，通过促进ACAN和COL2的表达和分泌来加速受损ECM的修复，从而有效治疗IVDD。
方案1. HA-NCSN/Cu 水凝胶抗氧化和光热疗法修复 IVDD示意图
【HA-NCSN/Cu 水凝胶的制备】
图1首先展示了不同铜离子浓度下HA-NCSN/Cu水凝胶的制备，发现随着Cu2+浓度增加，水凝胶的交联密度增强，微孔尺寸减小。扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）表明，水凝胶具有均匀的多孔结构，Cu2+均匀分布，并形成了2-4纳米的纳米颗粒簇。X射线光电子能谱（XPS）分析显示，部分Cu2+在凝胶过程中被还原为Cu+，表明硫脲基团与Cu2+之间发生了强烈的配位反应。基于第一性原理的Bader电荷分析也表明，硫脲基团将部分电子转移到Cu2+，从而降低其氧化态。
图1. HA-NCSN/Cu水凝胶的制备
【HA-NCSN/Cu 水凝胶的特性】
图2展示了了HA-NCSN/Cu水凝胶的流变学性质、抗氧化性能、光热效应及其在IVDD治疗中的潜力。结果表明，HA-NCSN/Cu水凝胶具备优异的剪切稀化、自愈性和抗疲劳性能，且表现出良好的注射性和机械强度，尤其是HA-NCSN/Cu3，具有类似人髓核的弹性模量。水凝胶的抗氧化能力可有效清除DPPH和OH·自由基，主要归因于HA-NCSN聚合物。通过近红外光照射，HA-NCSN/Cu水凝胶表现出极好的光热效应，并具备可控性和可重复性。体内实验表明，水凝胶在髓核组织内可通过外部近红外光触发加热，为体内光热治疗提供了基础。
图2 HA-NCSN/Cu水凝胶的特性
【HA-NCSN/Cu水凝胶在炎症环境下对NP细胞的保护作用】
图3展示了水凝胶对NP细胞炎性的抑制作用。通过HA-NCSN/Cu3水凝胶进行体外和体内实验，评估其对髓核细胞（NP细胞）的生物相容性和抗炎效果。CCK-8实验结果表明，HA-NCSN/Cu水凝胶在近红外（NIR）照射下不影响细胞活性和增殖。HA-NCSN/Cu水凝胶显著抑制了TNFα诱导的炎症反应，增强了胶原Ⅱ（Col2a1）和聚集蛋白（Acan）的基因表达，并降低了Mmp3和Mmp13的基因表达，显示出有效的抗炎作用。与HA-NCSN/Cu组相比，HA-NCSN/Cu+NIR组显示出更优的治疗效果，表明其光热性能对抑制炎症、促进NP细胞活性及加速IVDD修复具有重要作用。
图3. 体外 NP 细胞再生评估
【HA-NCSN/Cu水凝胶清除ROS对NP细胞的影响】
为了进一步探讨HA-NCSN/Cu水凝胶抗氧化和光热作用调节髓核细胞的机制，研究通过RNA-seq分析了不同处理组（TNFα、TNFα/HA-NCSN/Cu、TNFα/HA-NCSN/Cu+NIR）对髓核细胞的影响。结果显示，TNFα处理上调了1546个基因，下调了1015个基因，而HA-NCSN/Cu处理则调节了553个基因的上调和582个基因的下调。KEGG分析揭示，PI3K-Akt、TNF和IL-17信号通路在TNFα/HA-NCSN/Cu组中发生显著变化。进一步分析发现，HA-NCSN/Cu水凝胶通过调节谷胱甘肽代谢通路（GSH）抑制ROS生成，显著提高了抗氧化因子Nrf2和Hmox1的表达，表明其具有抗氧化和清除ROS的作用，从而保护髓核细胞免受炎症和氧化损伤。
图 4. HA-NCSN/Cu 水凝胶抑制 TNFα 诱导的 氧化应激。
【HA-NCSN/Cu水凝胶通过光热效果激活TGF-β信号通路影响髓核细胞】
进一步比较了TNFα/HA-NCSN/Cu组与TNFα/HA-NCSN/Cu+NIR组的转录组表达差异。结果显示，NIR诱导了158个基因上调和181个基因下调。KEGG分析表明，TGF-β信号通路在TNFα/HA-NCSN/Cu+NIR组中显著变化，GSEA分析也显示所有差异表达基因（DEGs）显著富集于TGF-β信号通路。热图分析揭示，NIR显著影响了与TGF-β通路相关的基因表达，Smad家族蛋白在该通路中起核心作用。TGF-β信号通路对髓核退变（IVDD）具有保护作用，可促进基质合成、抑制基质降解和炎症反应。Western blot结果显示，NIR显著上调了磷酸化Smad2（pSMAD2）和磷酸化Smad3（pSMAD3）的蛋白水平，表明TGF-β通路被激活。综上所述，HA-NCSN/Cu水凝胶结合光热治疗（PTT）通过激活TGF-β/Smad信号通路，有助于抵抗TNFα诱导的炎症损伤。
图 5. RNA-seq 显示 HA-NCSN/Cu/NIR 激活 TGF-β 信号通路。
【使用大鼠 IVD 模型进行体内评估】
图6展示了用针刺诱导的SD大鼠IVDD模型评估HA-NCSN/Cu水凝胶在体内的治疗效果。实验分为四组：未针刺组（对照组）、针刺组、HA-NCSN/Cu水凝胶注射组和HA-NCSN/Cu水凝胶注射+NIR组。CT成像显示，HA-NCSN/Cu和HA-NCSN/Cu+NIR组在术后8周的椎间盘高度指数（DHI%）显著高于针刺组。组织学评估结果显示，针刺组（组II）表现出严重的细胞浸润和高度紊乱的盘结构，而HA-NCSN/Cu组和HA-NCSN/Cu+NIR组则显示出较为完整的髓核和有序的纤维环组织。免疫组化结果也表明，HA-NCSN/Cu水凝胶显著增加了COL2A1和ACAN的表达，并降低了MMP3和MMP13的表达，表明HA-NCSN/Cu水凝胶结合NIR可有效延缓IVDD进程并促进其再生。
图 6. 使用大鼠IVD模型进行体内评估。
【小结】
本文开发了一种还原性交联的HA-NCSN/Cu水凝胶，并探索了其对IVDD的治疗效果。HA-NCSN/Cu的合成简单高效，具有可注射性、自修复、ROS清除和光热特性等特性。基于其抗氧化和光热特性的协同作用，一石二鸟设计已成功证明用于逆转NP细胞损伤。一方面，HA-NCSN优异的ROS清除能力缓解了炎症微环境，并调节了NP细胞的ROS生成相关谷胱甘肽代谢信号通路。另一方面，PTT显著上调NP 细胞COLL2和ACAN的表达，同时下调 MMP3和MMP13的表达。此外，轻度PTT还通过激活TGF-β/Smad信号通路增强了IVDD的ECM再生。体内实验最终验证了HA-NCSN/Cu通过协同处理实现了显著的IVD再生。这些结果表明，基于HA-NCSN/Cu水凝胶的微创协同治疗在逆转IVDD方面具有巨大的治疗潜力，其中轻度PTT可能为IVDD治疗提供新的见解。
原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202411290
