蔡仲雨教授团队《Prog. Mater. Sci.》综述: 基于蛋白质/肽的刺激响应型水凝胶及其传感应用
刺激响应性水凝胶是一种含有大量水的三维智能材料，可对不同的外界刺激做出响应。典型的聚合物水凝胶可以以低成本设计并应用于多种刺激。然而，这些聚合物水凝胶缺乏特异性，对特定生物刺激或生物分子的感知能力较差。使用蛋白质、多肽、适配体等生物分子制备新兴刺激响应性水凝胶是解决上述问题的有效策略。
近期，北京航空航天大学蔡仲雨团队在《Progress in Materials Science》上发表了题为《Stimuli-responsive hydrogels based on protein/peptide and their sensing applications》的综述。文章对近年来快速发展的基于蛋白质/多肽的刺激响应性水凝胶领域的最新进展进行了详细的讨论与总结，强调了由不同构建单元制备的基于蛋白质/多肽的水凝胶以及它们独特的结构和性质，回顾了基于蛋白质/多肽的刺激响应性水凝胶在物理、化学和生物传感器应用方面的最新进展，讨论了其当前面临的挑战并展望了未来的发展方向（图1）。
图1 刺激响应性蛋白质/多肽基水凝胶的构建单元及由其构建的传感器。
蛋白质/多肽类聚合物是制备螺旋交联水凝胶的主要原料，其性能可精确调控。随着对蛋白质和多肽认识的不断深入，研究人员开发了一系列天然的螺旋形成肽，如胶原肽和亮氨酸拉链，它们被用作各种水凝胶的交联位点。卷曲螺旋是由两个或多个相互缠绕的α螺旋形成的超螺旋结构。它们的形成是由不同的非共价相互作用驱动的，比如疏水相互作用、范德华力和电荷-电荷相互作用。研究人员可以通过调整聚合物链的序列、长度和数量来设计超螺旋卷曲螺旋结构域，进一步精确地调整水凝胶网络的性质。了解卷曲螺旋的机制可以更好地制造螺旋交联水凝胶。左手卷曲螺旋具有七肽重复序列，其中七个氨基酸残基表示为“a-b-c-d-e-f-g”。按此顺序，“a”和“d”位置大多为非极性疏水残基，而其他位置则包含亲水残基。右手卷曲螺旋通常具有十一个氨基酸的重复序列。超螺旋的形成是通过卷曲螺旋的扭曲而发生的，这些稳定的卷曲螺旋堆积促进了疏水核心的形成，可用于封装疏水分子和 DNA。卷曲螺旋内的疏水核心可以作为药物载体用于药物输送。将卷曲螺旋作为交联点可以作为一种通用的设计策略来制备许多新型蛋白质/多肽基水凝胶（如图2所示）。
图2 (A) 卷曲螺旋肽自组装形成动态水凝胶的示意图。(B) (i) γPFD-K2E2水凝胶自组装示意图。预折叠蛋白的C端用带负电 (E-coil) 肽和带正电 (K-coil) 肽的交替片段进行修饰。(ii) 用K2E2卷曲修饰的γPFD 和γPFD 的 TEM 图像。(iii) 倒置管中形成的预折叠蛋白水凝胶的照片。(C)丙烯酰化L-PHPG 和丙烯酰化DL-PHPG 交联的水凝胶网络示意图。
基于肽的β片层和β发夹是通过协同非共价相互作用（包括氢键、静电相互作用和疏水相互作用）形成的。形成β片层的肽通常由阳离子、疏水和阴离子氨基酸残基的交替序列组成，所得的片层相互结合，产生缠绕的纤维原或弯曲的肽表面。一些纤维原通过分支交联点连接，形成独立的水凝胶网络。β片层和β发夹水凝胶的协同分子间相互作用使其具有独特的性能。具体而言，源自β片层的水凝胶在高温、高盐浓度和变性剂存在条件下仍然保持了显著的稳定性。由于伤口环境中通常存在高浓度的蛋白酶，因此这种具有极佳稳定性的水凝胶有望用作伤口敷料。此外，这些水凝胶在植入生物体后通常不会引起炎症或强烈的免疫反应。这一发现至关重要，因为由于人体的异物反应，植入式水凝胶被封装后其有效性会显著降低。最近，许多研究者通过利用多肽的 β 片层和 β 发夹肽构象变化开发蛋白质/多肽基水凝胶（如图3所示）。
图3 (A) Fmoc-F/PAAm杂化双网络水凝胶的凝胶化过程示意图。(B) 由一系列新型超短胶原蛋白模拟三肽和非胶原蛋白水凝胶剂共组装而成的杂化水凝胶的设计。(C) PAH/Fmoc-FFpY 超分子水凝胶的示意图：(i) PAH和Fmoc-FFpY之间的静电相互作用，导致(ii) 通过Fmoc-FFpY和PAH溶液的简单混合制备PAH/Fmoc-FFpY水凝胶。(D) (i) AP对Fmoc-FFpY进行去磷酸化，生成胶凝剂Fmoc-FFY：示意图 (ii) Fmoc-FFY 纳米纤维（蓝色）由 NPs@AP 通过 Fmoc-FFpY 去磷酸化自组装而成，生成 (iii) 混合超分子水凝胶，该水凝胶随时间发生相分离。
蛋白质/多肽基水凝胶的一个特别有益的特性是，它们的动态特性源自蛋白质/多肽与特定生化配体的反应引起的构象变化。最近，经历三级构象变化的蛋白质/多肽也被纳入水凝胶网络中。在折叠过程中，蛋白质和肽会重新组织其层次结构，以达到最小自由能状态。配体的结合会改变蛋白质的能量格局，促使蛋白质或肽折叠成不同的三级结构，这可能涉及重新配置的螺旋、β-发夹、β-折叠和/或非结构化区域。构象变化是不同蛋白质/肽家族中的常见现象。事实上，已知大量蛋白质/多肽会发生构象变化，这些变化已被彻底表征。蛋白质/肽构象变化可分为具有不同特征的蛋白质/肽运动。其中，代表性的例子是“铰链运动”和“剪切运动”。“铰链运动”是蛋白质或多肽运动的一大类，可发生在α-螺旋或β-片层的末端区域。此外，蛋白质和多肽还会产生“剪切运动”，涉及在具有分层结构域的蛋白质内成对垂直螺旋之间的界面处高达100度的旋转。如上述例子和其他例子所示，二级结构的排列对于确定蛋白质/肽的潜在三级运动至关重要。此外，引入响应性聚合物是获得动态蛋白质/肽水凝胶系统的另一种有效方法。响应性聚合物通常通过改变其物理或化学性质来对环境变化做出反应，例如温度（PNIPAM）、pH（聚丙烯酸）、离子（聚电解质）和光（含偶氮苯的聚合物）。一系列物理刺激，化学刺激或生物刺激（如图4所示）下可进行响应的动态蛋白质/多肽基水凝胶被总结。
图4 (A) 化合物1-4的化学结构以及可能的反应方案，展示了暴露于各种小分子时凝胶到溶胶的相变。(B) (i) 抗原抗体半互穿网络水凝胶暴露于游离抗原时膨胀的机制。(ii) 抗原抗体半互穿网络水凝胶的制备方法。(C) 与AKtm/DTT 交联的HPMA基水凝胶以及水凝胶在底物作用下的宏观运动。
虽然大多数蛋白质/多肽基水凝胶都依赖于上述先进制备策略，但也有一些蛋白质/多肽基水凝胶可以通过交联单体直接实现制备。蛋白质和肽由多种氨基酸组成，这意味着这些氨基酸可以作为交联位点来形成蛋白质/多肽基水凝胶。高反应效率和温和的反应条件对于制备保留活性的蛋白质/多肽基水凝胶非常重要。因此，仔细选择化学反应和蛋白质或多肽中的氨基酸残基至关重要。在各种天然氨基酸残基中，一些氨基酸和功能团经常被用作交联位点，例如赖氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和对叠氮基苯丙氨酸等。
图5 (A) Con A-白色念珠菌表面甘露聚糖结合示意图。(B) (i)葡萄糖诱导的GGBP构象变化 (ii)葡萄糖结合诱导的2D PC GGBP水凝胶VPT引起衍射蓝移。(C) 2D PC HRP/BSA 蛋白复合水凝胶传感器选择性检测H2O2伴随红移。(D) (i)用于制作PNC-BSA水凝胶的单步蛋白质展开-化学偶联 (PNC) 方法；(ii) BSA 分子内羧基和氨基之间发生的EDC/NHS偶联反应。
在此基础上，文章总结了近年来基于蛋白质/肽的刺激响应性水凝胶作为传感器的应用（如图5和图6所示）。根据成分可以将基于蛋白质/肽的水凝胶分为纯蛋白质水凝胶传感器或者杂化蛋白质/肽水凝胶传感器。蛋白质水凝胶因其独特的分子识别能力而具有重要的生物技术应用。利用蛋白质水凝胶制备的传感器具有选择性好、生物相容性好、可生物降解、细胞毒性低、免疫原性高等优点，在临床诊断、疾病监测等方面具有广阔的应用前景。而将聚合物与蛋白质/肽结合形成杂化蛋白质/肽水凝胶具有引入新特性的潜在优势。具体来说，蛋白质/肽通常对各种刺激表现出独特的响应性，合成聚合物则具有更好的机械强度和多样化的单体结构，而现代可控聚合技术的发展为控制各种聚合物的重要结构参数提供了有效的方法。基于蛋白质/多肽的刺激响应性水凝胶已经在物理传感器，化学传感器和生物传感器方面得到了广泛的应用。
图6 (A) (i) 开发激酶响应CCA生物传感器。(ii) 使用肽底物 (LRRASLG) 对水凝胶进行功能化，该肽底物在暴露于蛋白激酶A (PKA) 时会膨胀。(iii) 随着固定的带负电基团浓度的增加（在pH=5.5时），观察到水凝胶封装的CCA的峰值光学反射率发生红移，同时水凝胶中的颜色发生变化。(B) (i) 利用点击化学对肽进行功能化，创建具有光学衍射特性的激酶响应水凝胶。(ii) 光学衍射水凝胶响应激酶磷酸化。由于肽功能化和磷酸化引起的晶格间距变化，水凝胶会发生可逆性溶胀和颜色变化。
此外，基于上述智能凝胶材料，刺激响应性蛋白质/多肽基水凝胶还被制备成可穿戴的智能传感器，用于监测人体生理特征及健康监测（图7）。
图7 (A) PAAm/酪蛋白水凝胶示意图。(B) (i) LysMA 的合成途径和 (ii) 聚 (LysMA-co-AAm) 水凝胶的网络结构。(C) P(AAm/AMPS)-AFPS 水凝胶的制备示意图。(D) 具有各种可调性能的水凝胶示意图及其在可穿戴传感系统中的应用。
最后，文章对刺激响应性蛋白质/多肽基水凝胶领域的研究现状进行了总结，讨论了该领域中面临的挑战，提出了相应的解决思路，并对未来的发展方向进行了展望（图8）。
图8 刺激响应性蛋白质/多肽基水凝胶领域的总结与展望。
上述工作得到了国家自然科学基金、国家青年人才项目、陕西省科技资源开放共享平台项目等的资助。北京航空航天大学博士研究生赵芳媛是论文第一作者，蔡仲雨教授为论文的通讯作者。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.pmatsci.2024.101355
