华东理工刘润辉教授课题组《Sci. Adv.》：从抗菌机理角度设计β多肽聚合物用于治疗耐药菌感染

2023-01-26 来源：高分子科技

抗生素的广泛使用导致耐药细菌的快速出现与传播，新型抗生素开发愈发缓慢将导致人类面对耐药菌的感染时“无药可用”，人类即将进入后抗生素时代。因此，迫切需要开发对耐药菌具有抗菌活性并且不易产生耐药性的新型抗菌剂。刘润辉教授课题组长期从事模拟宿主防御肽的研究，致力于解决耐药菌感染难题和发现抗耐药菌化合物。基于手性和异手性多肽可能出现的不同抗菌机理的转变，本研究通过以打破多肽聚合物的手性改变多肽聚合物抗菌机理为设计思路，发现了具有高效抗耐药菌活性和良好生物安全性的多肽聚合物。

宿主防御肽具有高效、广谱的抗菌活性且不易导致细菌产生耐药性因而被广泛研究。然而宿主防御肽容易被酶解、合成繁琐、价格昂贵导致其实际应用受限。天然宿主防御肽及其模拟物的作用机制一般靶向于细菌膜，而手性的多肽结构在与细菌膜作用时形成的α螺旋结构，更容易破坏细菌膜的完整性。一些异手性宿主防御肽及其模拟聚合物与细胞膜的相互作用很弱，能穿过细菌膜作用于细菌内部。这启发作者以改变多肽聚合物的手性改变多肽聚合物抗菌机理为策略设计抗菌多肽聚合物，同时使用生物相容性好的氨基酸亚基加入到多肽聚合物的主链中，获得具有高效抗耐药菌活性和良好生物安全性的β?多肽聚合物。在本研究中，β?多肽聚合物可抵制酶解，可通过阴离子开环聚合“一锅法”大量合成。研究发现优选β?多肽聚合物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）具有高效的抗菌活性和生物安全性（图1）。这一研究表明，打破多肽聚合物手性以转变破膜抗菌机理为穿膜抗菌机理设计β?多肽聚合物的策略是发现潜在抗菌多肽聚合物有效策略。该成果以“Switching from membrane disrupting to membrane crossing, an effective strategy in designing antibacterial polypeptide”为题发表在《Science Advances》（Science Advances, 2023, DOI: 10.1126/sciadv.abn0771）。

图1 打破多肽聚合物手性以转变破膜抗菌机理为穿膜抗菌机理设计低毒性β?多肽聚合物的策略，以应对耐药菌感染。

本研究使用外消旋β?赖氨酸内酰胺单体通过阴离子开环聚合合成异手性的β?多肽聚合物，同时在β?多肽聚合物中引入β?甘氨酸亚基有效地减少β?多肽聚合物毒性而保留其抗菌活性。作者筛选了一系列具有不同β?赖氨酸和β?甘氨酸亚基比例的β?多肽聚合物的抗MRSA活性、细胞毒性和溶血毒性，最终优选的β?多肽聚合物对MRSA展现出高效的抗菌活性（最低抑菌浓度MIC = 25 μg/mL），同时对优选的β?多肽聚合物具有较低的溶血毒性（5%血红细胞损失浓度HC₅ > 2000 μg/mL），而且对哺乳动物细胞有较低的细胞毒性（半抑制浓度IC₅₀ > 200 μg/mL）。β?甘氨酸的引入没有降低多肽聚合物的抗菌活性，同时有效地减少β?赖氨酸聚合物毒性，且溶血毒性和细胞毒性随着β?甘氨酸亚基比例的增加而减小（图2），优选的β?多肽聚合物与β?赖氨酸均聚物相比展现出较高的选择性。

图2 β?多肽聚合物的合成与表征，抗菌活性和体外生物相容性。

图3优选的β?多肽聚合物显示出强大的抗菌活性，无毒性，且不容易产生抗药性，对休眠细菌也具有高效的抗菌活性。

优选β?多肽聚合物对多株临床分离的金黄色葡萄球菌（包括5株MRSA）具有高效的抗菌活性（最低抑菌浓度MIC = 25?50 μg/mL），同时对多种哺乳动物细胞表现出较低的细胞毒性（半抑制浓度IC₅₀ > 200 μg/mL）。优选的β?多肽聚合物在耐药性方面也展现出突出的优点，使用优选β?多肽聚合物连续刺激细菌超过483代没有产生耐药性，而抗生素环丙沙星刺激的细菌获得了高达250倍的耐药性；经过β?多肽聚合物连续刺激的细菌也未对其他抗生素产生交叉耐药性，而与之形成鲜明对比的是，经环丙沙星刺激的细菌对多种抗生素产生了交叉耐药性。此外优选的β?多肽聚合物对MRSA休眠细菌同样具有灭杀能力，而抗生素则无效。

图4 优选的β?多肽聚合物的抗菌机理。

为了研究优选的β?多肽聚合物的抗菌机理，作者使用荧光分子标记的聚合物通过荧光共聚焦显微镜观察其杀菌过程。结果表明多肽聚合物并未在细菌膜表面富集，而是直接穿过细菌细胞膜进入细菌内部，作用于细菌内部一段时间后杀死了细菌，随后PI进入细菌内部表明细菌死亡后细菌膜受损。细菌质膜去极化实验结果也发现聚合物穿过细胞膜的过程中引起了微弱的质膜扰动，进一步研究发现多肽聚合物在进入到细菌内部后与DNA发生强烈作用，且细菌与聚合物共孵育后活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）水平在50 min内提高了6倍。而通过添加抗氧化剂猝灭大量生成的ROS使其降低至细菌正常水平后，多肽聚合物抗菌活性明显降低。TEM的结果表明经过多肽聚合物处理的细菌内部出现了黑色的胞质沉淀，且死亡细菌的细胞结构遭到了破坏，SEM的也结果表明经过多肽聚合物处理后细菌的细胞膜出现了皱缩和凹陷。综合上述实验结果，作者推测多肽聚合物可能通过与DNA结合产生高水平ROS相关的复杂机制杀菌，高水平ROS可以通过破坏细菌膜和内部的氧化还原平衡来杀死细菌。

图5 优选的β?多肽聚合物在MRSA全皮层伤口感染、角膜炎和大腿感染模型中的治疗潜力。

作者评估了优选的β?多肽聚合物治疗局部感染的潜力。实验结果表明，在小鼠MRSA全皮层伤口感染、角膜炎、和粒细胞减少的大腿感染模型中均显示出相当甚至优于“最后一线”抗生素万古霉素的体内杀菌活性。

图6 优选的β?多肽聚合物在MRSA肺炎感染和系统性腹膜炎感染模型中的治疗潜力。

作者进一步评估了优选的β?多肽聚合物在治疗更加严重的感染模型如肺炎感染模型和系统性腹膜炎感染模型中的治疗潜力。实验结果表明，在MRSA感染的肺炎模型中，通过多肽聚合物雾化治疗能大幅度提高感染小鼠的存活率，分析小鼠肺器官的细菌负荷发现多肽聚合物治疗肺部感染的效果与万古霉素相当。在MRSA系统性感染的腹膜炎模型中，通过多肽聚合物腹腔单剂量治疗能大幅度提高感染小鼠的存活率，分析小鼠主要器官、血液和腹腔液中的细菌负荷发现多肽聚合物治疗MRSA全身性系统感染的效果万古霉素相当。动物实验的结果表明优选的β?多肽聚合物在各种耐药菌感染的模型中均具有较好的治疗效果。

图7 β?多肽聚合物在小鼠体内毒性的评估。

体内毒性研究表明，单次尾静脉注射优选β?多肽聚合物浓度达到40 mg/kg小鼠全部存活，而单次注射12.5mg/kg的β?赖氨酸均聚物后小鼠在1小时内全部死亡。且注射优选β?多肽聚合物短期和长期内小鼠肝脏和肾脏的临床重要生物标志物没有明显差异，在组织学分析中也没有观察到明显的组织损伤。上述实验结果表明优选的β?多肽聚合物具有较低的体内毒性，其有望作为一种有效和安全的抗菌剂以应对耐药菌感染的挑战。

华东理工大学研究生张昊东，博士后陈琦，研究生谢佳洋是该论文的第一作者，刘润辉教授为通讯作者。该成果得到了国家自然科学基金委等基金的资助。

论文链接: http://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abn0771

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（责任编辑：xu）

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