细胞培养肉作为一种颠覆性的肉类生产技术，旨在通过体外大规模扩增并诱导分化肌肉干细胞以获得与真实肉相似口感及营养价值的肉替代产品，具有绿色可持续、营养可控、环境污染小等优势，是未来食品的重要发展趋势。该技术的关键挑战之一在于可食用三维生物支架的开发。三维生物支架具有与细胞外基质相似的微观结构，可为细胞黏附、增殖和分化提供指导，促进氧气与营养物质的交换。用于培养肉的支架材料应是可食用和消化的、有良好的细胞亲和性并能大规模和低成本获得的。

  静电场电流体喷射3D打印技术（EHDP）能够制备微结构可控的超细纤维支架，因其纤维尺寸与细胞大小相似，可以高度还原细胞外基质环境，从而控制细胞的生长行为，被广泛用于三维细胞培养与组织工程等领域。然而，由于该技术对打印墨水的性质有很高的要求，目前尚可应用的墨水材料十分有限且多为合成高分子材料，难以满足制作细胞培养肉的基本需求，故制造可食用级的3D打印支架还需探索食品级墨水材料。

  近日，新加坡国立大学食品科学与工程系黄德建教授团队首次以谷物醇溶蛋白（玉米、大麦和黑麦蛋白）为原料，成功制备具有合适流变性质的纯植物基墨水，并通过高精度3D打印技术制造了微结构可控的谷物醇溶蛋白纤维支架，由此制备出具有组织相似性的细胞培养猪肉片原型，为细胞培养肉的生产提供了新思路。

图1、 基于静电场电流体喷射打印技术（EHDP）生产可食用醇溶蛋白支架及细胞培养肉的示意图

  为获取制备三维支架的原料，首先从谷物中提取出醇溶蛋白，包括玉米醇溶蛋白（zein）、黑麦醇溶蛋白（secalin）及大麦醇溶蛋白（hordein）。通过调整醇溶蛋白墨水浓度和不同醇溶蛋白的比例，获得与EHDP技术常用的聚酯内酯（PCL）墨水具有相似流变行为及电导性能的纯植物蛋白墨水。在静电场电流体喷射打印平台上，通过实时监测打印针头喷射溶液的状态，优化打印条件（包括加载电压、针头-底板间距离、环境温度和湿度等），从而获得稳定的喷射泰勒锥，形成连续沉积纤维。通过设计打印程序，EHDP技术可精确控制可食用谷物醇溶蛋白支架（zein/hordein及zein/secalin）的微观结构，包括纤维直径、孔径、孔隙、孔型和厚度等。通过扫描电镜观察到打印的谷物醇溶蛋白支架呈孔径为400 μm的多层有序多孔结构。在维持良好力学性能的同时，支架的孔隙率高达88%，其有利于细胞培养过程中的营养物质、氧气及废物运输（图2）。

图2、 （A）zein/secalin支架实物图；（B-D）zein/hordein、（E）zein/secalin、（F）PCL支架的SEM微观结构图；（G-H） 醇溶蛋白支架的水合作用；（I）醇溶蛋白支架的力学性质。

  为深入探究醇溶支架在细胞培养的应用潜能，以骨骼肌细胞为模型，在支架上观察细胞行为。研究发现，C2C12小鼠成肌细胞与猪骨骼肌卫星细胞在醇溶蛋白支架上具有良好的黏附能力。经过11天培养后，细胞数量分别扩增至30倍和10倍以上，通过共聚焦显微成像可以观察到细胞逐渐填满支架的孔隙，表明支架良好的生物相容性。此外，区别于二维贴壁生长，三维支架上生长的骨骼肌细胞较为细长，具有与体内肌肉组织更相似的微观形貌（图3）。

图3、 （A）C2C12细胞和（B）猪骨骼肌卫星细胞在PCL及醇溶蛋白支架上的增殖；（C）C2C12细胞和（D）猪骨骼肌卫星细胞的共聚焦荧光显微成像图；（E）2D平板和3D支架培养下细胞的形貌对比（蓝色：DAPI，红色：鬼笔环肽）。

  为诱导骨骼肌干细胞分化形成成熟肌管，在血清饥饿诱导7天后，C2C12成肌细胞的结蛋白（desmin）、肌细胞生成素（myogenin）及肌球蛋白重链（myosin heavy chain）表达量显著升高，标志成肌细胞的分化与成熟。有趣的是，在血清饥饿前，支架培养的细胞肌球蛋白重链蛋白的表达量已显著高于二维培养，说明三维支架培养可加速成肌细胞分化。同时，在猪骨骼肌卫星细胞的肌细胞生成素表达量也显著提高，进一步表明干细胞在三维支架培养上的分化潜能（图4）。

图4、 （A）C2C12细胞和（B）猪骨骼肌卫星细胞黏附相关基因的表达；（C）C2C12细胞和（D）猪骨骼肌卫星细胞肌源调控因子的表达；（E）骨骼肌干细胞分化示意图（蓝色：DAPI，红色：鬼笔环肽）。

  此外，醇溶蛋白支架具有良好的稳定性，在培养细胞后，仍维持原有的微结构。值得一提的是，在细胞培养一周后，蛋白纤维表面自发形成微孔结构，说明体外降解性。作为概念性的验证，通过在蛋白支架上连续培养并诱导分化肌肉干细胞12天后，可以获得直径为2.5厘米的人造猪肉片。

图5 （A）醇溶蛋白支架在PBS中浸泡7天、（B）培养肌肉细胞2天、（C-D）培养5天后的形貌图；（E-F）人造肉模型。

  文章链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adma.202207397

  DOI: https://doi.org/10.1002/adma.202207397