先天性缺陷、外伤、肿瘤、原发性肌病、代谢性疾病等各种原因造成的骨骼肌缺损和功能丧失是临床常见的病例。传统治疗方法主要是肌皮瓣移植，但由于可利用的自体肌肉来源有限，对供区损伤较大给病人带来新伤害；而异体移植供体同样面临来源有限，且存在免疫排斥等问题，使其应用受到限制。组织工程方法是将体外培养和扩增的高浓度功能相关组织细胞种植在一种生物相容性好、同时能够被机体降解的生物材料上，即组织工程支架材料，形成材料-细胞复合物，将此复合物移植到所需部位，在机体内细胞继续增殖，而支架材料逐渐被降解、吸收，从而达到修复受损组织或重建功能的目的。基于组织工程方法体外构建血管化肌肉微组织，有望解决骨骼肌组织缺损和功能丧失等问题。

  华侨大学陈爱政教授课题组和哈佛医学院Y. Shrike Zhang教授课题组基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）多孔微球及聚乙二醇（PEG）中空短棒状微纤维，分别通过成肌细胞（C2C12）与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的负载成功构建血管化肌肉微组织，并通过共同注射的方式研究该肌肉微组织在血管化肌组织原位方面的应用（图1）。

图1. 研究示意图。

  首先，利用微流控技术制备了PLGA大多孔微球（PLGA PMs）并体外构建微组织（图2）。通过微流控技术制备的PLGA PMs平均粒径为395 μm，拥有开放且相互贯通的孔洞，孔径为10-60 μm。在PLGA PMs中接种C2C12，通过动态培养法探索细胞组织聚集体的形成条件及肌肉微组织的形成过程，构建3D肌肉微组织模型。结果发现，在共培养7天后，分散性良好的微球之间开始聚集，并在后续培养过程中形成组织团块。

图2. 基于PLGA PMs体外构建肌肉微组织

  然后，通过微流控技术和光聚合技术相结合得到负载HUVECs的中空短棒状血管微组织。以丙烯酸-聚乙二醇-琥珀酰亚胺基羧甲基酯（Acr-PEG-NHS）为原料，以共价修饰的方法得到了细胞活性好的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-PEG-Acr（RGD-PEG-Acr）及血管内皮生长因子-PEG-Acr（VEGF-PEG-Acr），并研究了修饰作用下材料的生物安全性及对HUVECs生长的调控作用。另外，采用复乳法制备载碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的PLGA纳米粒（NPs），并复合到PEG水凝胶网络中（图3）。利用微流控技术和UV引发光聚合技术制备了中空短棒状微纤维，微纤维外径约为350 μm、内径约为110 μm、厚度约为120 μm、长度约为1.5 mm，DAPI染色结果表明体外培养5天后，支架仍具有良好的中空结构及机械强度，HUVECs呈管状分布；且实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）方法分析结果显示促血管生成素（Ang-2）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和酪氨酸激酶-2（Tie-2）中特定信号传导部分的表达水平均有显著性提升，表明了体外血管形成的趋势。

图3. 基于PEG HMs体外构建血管微组织

  接着，为了进一步研究共混后的肌肉微组织及血管微组织在体内的作用情况，在已经形成的肌缺损部位注射入混合肌肉微组织、血管微组织作为实验组，同时分别注射生理盐水、乙醇、空白支架、混合细胞悬液为对照组，以造模后不处理作为空白对照组，观察SCID大体积肌缺损的肌肉修复和组织再生情况（图4）。通过HE染色观察注射后组织的水肿、纤维化、及肌细胞再生的情况。根据HE结果分析可以看出术后3 d内属肌组织的破坏、炎症阶段，3 d - 14 d为肌组织修复阶段，注射入机体的PLGA PMs由于含有大量成熟的C2C12细胞，且体外实验证明，在动态培养下C2C12-PLGA PMs能够出现自由聚集，这些聚集有助于微载体中的C2C12根据机体需要和自身的成肌细胞组装形成中心排列的核进而形成肌纤维。14 d - 28 d为肌组织重塑阶段，对于实验组来说，成纤维细胞的增生为合成结缔组织、为再生组织提供稳定的微环境起到重要作用，肌组织的修复基本完成。

图4. SCID右后腿胫前肌注射、肌肉微组织+血管微组织、乙醇、空白支架、生理盐水、细胞混悬液及空白对照组不同时间后HE染色分析

  通过Masson染色观察细胞在组织内部的作用及肌肉的损伤、炎症的修复及纤维化情况（图5）。Masson染色观察细胞在组织内部的作用及肌肉的损伤、炎症的修复及纤维化情况结果和HE染色结果大体一致，成纤维细胞的大量增殖过程导致了胶原纤维的产生，实验组在术后28 d时呈现出形状规则、红色均匀分布的肌组织形态，其它对照组均出现了不同程度的胶原纤维的过度再生和沉积，最终导致了瘢痕的形成，影响了骨骼肌组织功能的重建。

图5. SCID右后腿胫前肌注射肌肉微组织+血管微组织、乙醇、空白支架、生理盐水、细胞混悬液及空白对照组不同时间后的Masson染色分析

  最后，利用免疫荧光组织学染色观察组织内部不同组别血管生成相关因子CD31、VE-Cad的表达情况及肌纤维形成相关蛋白Desmin、MyoD的表达情况。研究结果表明，基于微流体控技术制备的大多孔高分子微球、中空短棒装微纤维作为微载体在构建血管化组织用于组织再生的研究具有潜在的应用前景。

  以上相关成果以“Minimally invasive co-injection of modular micro-muscular and micro-vascular tissues improves in situ skeletal muscle regeneration”为题，近期在线发表于《Biomaterials》。论文通讯作者为华侨大学陈爱政教授和哈佛医学院Y. Shrike Zhang教授，论文第一作者为华侨大学化学工程与技术2020届博士毕业生王颖。华侨大学王士斌教授、Ranjith Kumar Kankala副教授、张建庭讲师、2020届博士毕业唐含笑、2020届硕士毕业蔡园园、复旦大学中山医院朱铠副教授和福建医科大学杨达云副教授为论文的共同作者。

  华侨大学部分的研究工作得到国家自然科学基金（81971734，32071323）、国家自然科学基金海峡联合重点项目（U1605225）以及福建省生物材料科技创新团队项目的资助。

  论文链接：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.121072

作者简介：

陈爱政：博士、教授、博士生导师。

福建省优秀教师，入选国家百千万人才工程、被授予“有突出贡献中青年专家”荣誉称号。目前担任中国生物材料学会理事、中国生物材料学会复合材料分会秘书长、中国生物材料学会青年委员会委员、华侨大学生物材料与组织工程研究所所长、福建省生物材料科技创新团队带头人、福建省生物材料化工博士生导师团队带头人。主持国家自然科学基金海峡联合重点项目、面上项目、国家重点研发计划政府间国际科技创新合作重点专项等国家级课题8项。主要从事超临界流体技术及生物材料与组织工程领域的研究，已在AM、AFM、Small、JCR、CEJ、AHM、Biomaterials、Biofabrication等期刊发表SCI收录论文100余篇，获授权国家发明专利10余项。

课题组网页：https://www.x-mol.com/groups/hqubiomat 

Y. Shrike Zhang：博士，美国哈佛大学医学院助理教授，2013年于Georgia Institute of Technology生物医学工程系取得博士学位。研究领域包括生物打印及器官芯片的平台搭建与应用研究，在相关领域发表研究论文及综述240余篇，包括以第一或通讯作者发表的PNAS、Science、Nat. Rev. Mater.、Nat. Rev. Nephrol.、Nat. Commun.、Matter、Adv. Mater.、ACS Nano、Angew. Chem. Int. Ed.、Biomaterials 等，其中超过45篇封面文章；研究成果曾被BBC、Fox News、The Boston Globe/STAT News、Science Daily、Technology Networks、IEEE Spectrum、C&EN、《科技日报》等报道。担任20余本杂志的主编、副主编或编委，曾获得多种国际和地区性奖项40余项。

课题组网页：https://shrikezhang.com/