抗生素滥用导致的细菌耐药性已成为当今社会面临的严重威胁，因此亟需发展新型抗菌试剂。相较于抗生素，抗菌肽具有高杀菌活性、广谱抗菌性、不易产生耐药性等优点，是当前抗菌领域的研究前沿和热点。尽管已有多种抗菌肽被报道，但其作用机制尚不完全明确，部分原因是由于SEM、TEM、AFM等常规观测手段，仅能提供抗菌肽与细菌结合后的静态信息，难以揭示抗菌肽与细菌结合的动态过程。

  相对于上述静态成像技术，荧光成像具有成本低、易于操作、可实时原位观测等优点。由于抗菌肽在杀灭细菌时，通常需要高浓度聚集于细菌的表面或内部，而传统荧光染料存在聚集猝灭发光（ACQ）的缺陷，难以用于抗菌肽的作用机制研究。此外，传统荧光染料光稳定性差，难以长期实时监测抗菌肽与细菌的结合过程。因此，发展能够克服ACQ缺陷，且简便易得、光稳定性好的荧光探针，实时原位监测抗菌肽与细菌的结合过程，对揭示抗菌肽的作用机制具有重要意义。

  聚集诱导发光（AIE）材料具有聚集态发光效率高、斯托克位移大、生物相容性好、抗光漂白能力强等优点。近日，香港科技大学唐本忠院士团队与华南理工大学王迎军院士团队合作，通过在抗菌肽HHC36（KRWWKWWRR）上修饰AIE分子2-(2-羟基苯基)苯并噻唑（HBT），制备了AIE探针AMP-2HBT（图1），不仅保持了HHC36多肽的抗菌活性，而且由于其在稀溶液中发光很弱，可通过荧光“点亮”的方式，实时观测抗菌肽与细菌的结合过程，进一步通过STORM超分辨荧光成像、SEM和TEM成像，有效揭示了抗菌肽HHC36通过破坏细菌膜的结构从而杀灭细菌的机制。

图1 AIE探针AMP-2HBT的分子结构及其与细菌结合后点亮荧光并杀灭细菌的过程示意图。

  通过比较抗菌肽HHC36与探针AMP-2HBT的杀菌效率，发现在HHC36多肽上修饰HBT分子，并未影响其杀菌活性（图2）。例如，在10，20，50，100 μM浓度时，HHC36多肽和AMP-2HBT探针对大肠杆菌的杀灭效率分别为84.25，94.64，99.68，99.84%和87.56，94.33，99.53，99.95%。进一步研究发现，AMP-2HBT探针可迅速抑制细菌的活性，当将20 μM探针加入至细菌溶液（107 CFU mL–1）中时，所有细菌在2 min内即停止运动。

图2 (A) 不同浓度HHC36多肽及AMP-2HBT探针对大肠杆菌的杀菌效率；(B) 加入AMP-2HBT探针后，大肠杆菌的运动活性随时间的变化。

  探针AMP-2HBT具有典型的AIE性质，当其在稀溶液中时，由于分子内运动，荧光很弱；当其与细菌结合后，分子内运动受限，发出强荧光（图3A）。因此探针AMP-2HBT可用于细菌的免洗成像，实时监测抗菌肽与细菌的结合过程。进一步，基于荧光显微镜和流式细胞仪分析发现（图3B-F），随时间的延长，AMP-2HBT探针与细菌结合的数量逐渐增加，其荧光强度亦逐渐增加，在30，45，60 min时，探针结合至细菌后的平均荧光强度分别为15 min时的2.9，4.6，6倍。

图3 探针AMP-2HBT实时原位监测与细菌的结合过程：(A)探针AMP-2HBT和大肠杆菌自身，及与大肠杆菌结合后的荧光光谱；(B)–(E)不同时间下细菌的荧光照片；(F)不同时间下流式分析结果。

进一步，通过结合随机光学重建显微镜（STORM）、扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）分析发现，荧光探针AMP-2HBT可有效结合至大肠杆菌的细菌膜上（图4），通过破坏细菌膜的结构，导致细菌内容物流出，从而有效杀死细菌。

图4 (A，B) AMP-2HBT结合至大肠杆菌后的STORM超分辨荧光照片；(C，D) 分别为AMP-2HBT与大肠杆菌结合前后的TEM照片；(E，F)分别为AMP-2HBT与大肠杆菌结合前后的SEM照片。

  该工作通过在抗菌肽上修饰AIE分子，在不影响抗菌肽自身活性的前提下，可通过荧光成像实时动态观测抗菌肽与细菌的结合过程和作用方式，有效克服了传统荧光染料的聚集猝灭发光缺陷，为抗菌肽的机制研究提供了一种有效的研究工具。

  这一研究成果近期发表在《ACS Applied Materials & Interfaces》上，文章的共同第一作者为华南理工大学陈军建博士、高蒙副研究员和王琳副研究员，本文的通讯作者为唐本忠院士、王迎军院士和任力教授。

  论文链接：https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021%2Facsami.7b18221