中国科学技术大学化学与材料科学学院闫立峰教授团队以侧链带有羧基（-COOH）的天然二胺-赖氨酸为单体，利用有机超强碱DBU催化体系成功合成了赖氨酸-CO₂基聚脲（L-PU）。实验表明，CO₂以脲基团的形式（-NHCONH-）嵌入到主链，侧链活性羧基的保留率超过80%。同时产物具有非典型荧光特性，产物L-PU的荧光量子产率超过20%。L-PU对HepG2细胞的培养存活率超过90%，可高效标记细胞质，展现出优异的生物相容性与成像性能。此外，L-PU保留的活性羧基具有进一步功能化的改性空间，增加了其作为水溶性高分子的应用潜力。第一作者为中科大2022级博士研究生张尚中。

图1. L-赖氨酸捕获 CO₂并产生聚脲过程可能的机理

  该团队直接使用 L-赖氨酸作为二胺原料，在有机超强碱 DBU 的活化下，与 CO₂ 在温和的温度和压力下（0.1-0.4 MPa，60-100 ℃）进行捕获和聚合反应，成功制备了一种新型水溶性聚脲（L-PU）。

图2. a) L-PU 聚合物的 ¹³C NMR 谱（0.4 MPa, 80 ℃,12 h）；b) L-PU 聚合物的 ¹H NMR谱（0.4 MPa, 80 ℃,12 h）；c) 信号 1c 放大视图；d)分子链中三种可能存在形式

  在图2a 中，可观察到六个高化学位移的碳信号，将其按化学位移从低到高进行分类和归属，如图2 b，c，d所示。赖氨酸分子中共有五个碳原子，除了 1 号位置的碳原子只连着一个氢原子外，其它每个碳原子连着两个氢原子。而 1 号位置的碳原子共有 1a，1b 和 1c 三种连接情况。由此可见，信号 1-a、1-b、1-c 的合起来积分面积为 1 号碳原子总积分面积，1 号碳原子与其它碳的积分面积比值为 0.5:1:1:1:1。其中，信号 1-a 表示与 1 号碳原子相邻的脲基团，其另一侧无羧基；而信号 1-b 表示，在脲基团的另一侧有一个羧基。因此，由于另一侧羧基的吸电子作用，信号 1-b 的化学位移值相对于信号 1-a 有明显的增加。信号 1-a 与 1-b 的积分面积之比为 37:4，这是因为 1-a 是由赖氨酸中不与羧基相邻的氨基捕获 CO₂ 形成，其形成过程相比与 1-b 具有较低的位阻以及亲核性的优势，所以最终数量占优。

  1-c 信号代表由 1-a 结构进行分子内脱水，进而形成的五元环结构，其对应的化学位移更大。如图 5c 所示，核磁共振氢谱中 1-c 的信号为双二重峰（d-d 峰）。这种光谱特征表明，1-c 上的氢原子受到位于不同化学环境中的两个相邻氢原子的影响。在五元环结构中，2 号碳上的两个氢原子由于平面构象中位置不同，处在不同的化学环境，即满足这种情况。所以，上述对分子内产生五元环结构的假设，得到了有力的证据支持。

  此外，当该反应在不同的条件下进行时， 1-a、1-b 和 1-c 三个信号的峰值形状和比例几乎没有变化，大约是 70%:10%:20%。这说明，L-PU 中的三种结构在热力学上是较为稳定的。由此可知，活性羧基的保留率为 1-a 与 1-b 所占比例之和，约为 80%。

图3. L-PU在不同条件下的GPC曲线。（除特殊说明外，基本条件为0.4 MPa, 80℃，12h）。a)不同压强, b)不同温度, c)不同时间, d)不同时间合成的L-PU水溶液（2mg/ml）动态光散射（DLS）试验

  图3a 表明，当 CO₂ 压力从 0.4 MPa 降低到 0.1 MPa 时，L-PU 的重均分子量（M_w）增加，从 1.09×10⁴ g/mol 增加到 2.47×10⁴ g/mol, 表明即使在较低压力下，CO₂ 也能与赖氨酸进行有效聚合。 如图3b所示，温度升高导致重均分子量增加，而分散系数（PD）相对变化很小。这是因为温度的升高增加了反应的能量供给，降低了体系粘度，提高了传质效率。 当反应时间从 4 h 增加到 12h 时，分子量略有增加（从 1.05×10⁴ g/mol 增加到 1.09×10⁴ g/mol），表明链生长过程主要发生在反应的前 4 小时。然而，当反应时间从 12 小时增加到 24 小时，重均分子量和分散系数均显著增加（分散系数从 1.82 增加到 2.53），表明长时间加热可能导致分子间的链间反应。 图 3d进一步支持了这一观察结果，反应 24 h 后的 L-PU 水溶液由于分子链之间的反应和缠结，粒径更大，分布更广。

图4 纯化的 L-PU 聚合物的 SEM 照片（0.4 MPa,12 h,80 ℃）

  纯化后的 L-PU 固体粉末的微观形态特征如图 4.14 所示，通过 SEM 的表征方法，可以清楚地看到颗粒呈现出细长片状的形态。这可以归因于分子链中存在大量氢键，导致聚合物链间密集排列。

图5. a)不同条件下 L-PU 聚合物的紫外吸收光谱, b)不同条件下 L-PU 聚合物的荧光发射光谱， c) 不同压强下合成的 L-PU 聚合物的荧光量子产率与浓度变化关系 4 （12 h,80 ℃,λex=310 nm）, d) 不同反应时间下合成的 L-PU 聚合物的荧光量子产率与浓度变化关系

  L-PU 聚合物的荧光强度随溶液中自身浓度的增加而降低，符合 ACQ （Aggregation-Caused Quenching）的原理。图5a中的 L-PU 聚合物，随着分子量的逐渐增加，其对应的紫外吸收峰从 302 nm 逐渐增加到 314 nm， 这说明非常规的本征荧光性质与聚脲的分子量有直接关系。在 310 nm 激发波长下，L-PU 聚合物在各种条件下都可以观察到荧光现象，如图5b所示。发射峰出现在 410 nm 左右。图 5c和5d的结果证实了 L-PU 聚合物的荧光量子产率随着浓度的增加而逐渐降低，符合聚集诱导猝灭（Aggregation-Caused Quenching）。

  值得注意的是，在 0.1 MPa 的 CO₂ 压力下合成的 L-PU 聚合物的量子产率高于 0.4 MPa 条件下的，而反应时间 24 小时合成的 L-PU 聚合物的量子产率超过了 12 小时合成的聚合物，说明荧光量子产率与分子量呈正相关。在测试过程中，观察到的 L-PU 聚合物的最大荧光量子产率达到了 20.39%，显著高于单体赖氨酸的荧光量子产率（5.35%）。

  利用YO-PRO1 细胞核染色液其进行了细胞核染色成像（图 6）。

图6. 被 L-PU 和 YO-PRO1 染色剂处理的 HepG2 细胞的荧光图像

  HepG2 细胞在摄取了含有 L-PU 聚合物的培养液 6 小时后，荧光图像显示 L-PU 分子存在于细胞质区。12 小时后，L-PU 聚合物的荧光强度显著增强，并保持相对稳定，直至 24 小时（图 7a）。 MTT 法测定细胞毒性如图7b所示，在摄取含有不同浓度 L-PU 的培养液情况下，测试细胞存活率保持在 90%以上，表明 L-PU 聚合物具有优异的生物相容性和细胞安全性。

图7. a)L-PU 处理不同时间后 HepG2 细胞的荧光强度, b) L-PU 对 HepG2 细胞的 MTT 分析（n = 4, mean±SD）, c) L-PU 溶液和水在 365nm 紫外光下对比（80 ℃,12 h, 0.4 MPa,2 mg/mL）, d) 经过 L-PU 染色的细胞轮廓（80 ℃,12 h, 0.4 MPa,2 mg/mL）

  L-PU 聚合物水溶液具有肉眼可见的显著荧光效果，如图7c所示。 此外，图7d显示了摄取 L-PU 聚合物后完整清晰的细胞轮廓，细胞边缘轮廓清晰，形状完好，这表明 L-PU 聚合物具有优异的细胞亲和性，因为它很容易被细胞吸收，同时保持了细胞的自然形态。

  DSC 测试的结果表明（图8a），L-PU 的玻璃化转变温度随着重均分子量的增加而逐渐升高。较高的分子量增强了分子链的刚性，也促进了更多分子间氢键相互作用。从图8b 中可以看出，不同条件下合成的 L-PU 聚合物在 122 ℃和 203 ℃左右表现出两个不同的失重步骤。在 122 ℃时，L-PU 聚合物分子失去了分子间结晶水，并在 203 ℃时开始分解。在 203 ℃附近的第一次失重，不同条件下 L-PU 聚合物没有表现出显著差异。然而，在 250 ℃附近的第二次失重，剩余质量表现出依赖于分子量的顺序。例如，在 12 h、0.1 MPa、80 ℃条件下合成的 L-PU 聚合物在第二次失重过程中分子量最高，保留的质量最多。

图8. a)不同条件下合成的 L-PU 聚合物的DSC曲线, b) 不同条件下合成的 L-PU 聚合物的热重曲线

  本研究成功开发了一种在温和条件下利用 L-赖氨酸与CO₂ 高效聚合制备水溶性聚脲（L-PU）的新方法。通过 DBU 的催化作用，L-PU 不仅实现了 CO₂ 的高效固定，还保留了羧基的活性，为其在生物医学领域的应用提供了广阔的前景。L-PU 表现出优异的荧光性能和生物相容性，能够高效标记细胞质，展现出其在细胞成像和组织治疗中的潜在应用价值。

  原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.macromol.4c03112

  下载：l-lysine Efficiently Polymerizes with CO2 under Mild Conditions for Biocompatible Fluorescent Polyurea