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东华大学沈明武/史向阳教授团队 ACS Nano:生物活性的含磷树状大分子作为通用型蛋白质递送系统用于增强的抗炎治疗
2024-01-12  来源:高分子科技

  蛋白类药物因其高特异性和低副作用而越来越被认为是药物开发和疾病治疗领域中有希望的候选者。然而,大多数蛋白质由于分子量大、膜渗透性差、易被酶降解等特点而难以穿过细胞膜并作用于细胞内疾病靶点。因此,开发针对细胞内疾病靶点的简单高效的蛋白质递送技术是扩大蛋白质药物应用场景的重要途径。


  一般来说,细胞内蛋白质递送的策略包括物理方法(如电穿孔、纳米针、微流控和T细胞介导的孔形成)或化学方法(如蛋白质与细胞穿透肽、转导结构域、两亲性小分子等渗透性模块的共价结合)。尽管这些细胞内递送蛋白质的方法有效,但也存在不可忽视的缺点,包括依赖于苛刻的设备条件、蛋白质化学修饰需要花费额外的时间和费用、细胞活力受损、蛋白质活性降低、内涵体逃逸效率差等。在这种情况下,基于非共价相互作用的纳米载体,如脂质体、纳米凝胶、外泌体和聚合物为有效的细胞内蛋白质递送提供了更多的选项。


  在众多的纳米载体体系中,表面修饰磷酯酸钠盐的阴离子型含磷树状/树冠大分子具有特定的生物活性,如抗炎、免疫调节、促进NK细胞增殖等特性。因此,各种基于含磷树状/树冠大分子的纳米平台已被构建用于化疗药物的胞内递送。其中,阳离子型含磷树状大分子、PAMAMPEI等高分子载体与蛋白质的相互作用已被报道并被应用到蛋白质的胞内递送中。然而,考虑到高密度的正电荷可能会导致不可预测的细胞毒性,因此,依赖负电荷递送蛋白质到细胞内的必要性需要重新评估。此外,大量载体的不合理使用所导致的代谢和清除不良,也可能引发机体毒性。因此,开发基于具有固有免疫调节活性的阴离子型含磷树状大分子的蛋白质胞内递送载体有望解决以上问题,并可通过载体和蛋白质的功能协同发挥增强的治疗效果。


  为了解决以上问题,东华大学沈明武/史向阳教授团队法国国家科学研究中心Jean-Pierre Majoral院士团队合作构建了一种基于亚磷酸钠盐封端的含磷树状大分子的蛋白质胞内递送载体(图1)。研究团队首先采用发散迭代法合成了5种分支中不含可水解C=N-N-Me片段的含磷树状大分子,筛选出抗炎活性和蛋白质递送性能最优的树状大分子AK-137AK-137可通过各种物理相互作用与蛋白质(包括牛血清白蛋白BSA、核糖核酸酶ARNase A、卵清蛋白OVA和纤连蛋白FN))复合实现多种功能蛋白的细胞内递送以发挥各自的生物学功能,并利用载体自身免疫调节活性与所递送的纤连蛋白之间的协同作用在急性肺损伤和急性痛风性关节炎模型中实现了增强的抗炎治疗效果。 


1. 含磷树状大分子AK-137通过各种物理相互作用与蛋白质络合用于细胞内蛋白质的递送。


  研究团队首先通过核磁共振氢谱、碳谱和磷谱证明了不同含磷树状大分子以及中间产物的成功合成(图2A)。其中,含磷树状大分子AK-137表现出最为优异的免疫调节性能,包括增加巨噬细胞表面CD206的表达、诱导巨噬细胞群体从M1表型极化至M2表型(图2B-D)、抑制促炎性介质亚硝酸盐的释放(图2E)。重要的是,AK-137对模型蛋白BSA的细胞内递送能力也高于其他含磷树状大分子(图2F)。 


2.A不同含磷树状大分子的结构图;(B-D流式细胞术分析不同含磷树状大分子处理RAW264.7细胞后细胞表面CD86CD206的表达变化;(E)含磷树状大分子抑制RAW264.7细胞释放亚硝酸盐的能力;(F)不同含磷树状大分子胞内递送BSA的效率。


  基于以上发现,研究团队选择了具有最佳抗炎活性和蛋白质递送性能的含磷树状大分子AK-137进行下一步研究。以BSA为模型蛋白,探讨AK-137的蛋白结合行为。动态光散射结果显示当含磷树状大分子AK-137BSA的质量比为121时,获得的复合物具有合适的水合粒径尺寸、表面电势以及最小的聚合分散系数(图3A-B)。同时,在此质量比下,AK-137可以有效诱导BSA的聚集,从而导致Cy5.5-BSA荧光信号的显著猝灭(图3C)。TEM图像显示获得的AK-137@BSA nanocomplexes (NCs具有尺寸大小为108.3 nm的均匀球形结构(图3D)。另外,AFM图像显示AK-137AK-137@BSA NCs间颗粒高度的差异也进一步证明了复合物的成功制备(图3E-F)。所获得的AK-137@BSA NCs具有良好的稳定性(图3G),并主要通过网格蛋白介导的内吞作用促进BSA的胞内递送(图3H-K)。 


3.A-BAK-137BSA在不同质量比下的水合粒径和表面电势;CCy5.5-BSA的荧光发射光谱;(DAK-137@BSA NCsTEM图像;(E-FAK-137AK-137@BSA NCsAFM图和相应高度图;(GAK-137@BSA NCs一周内的水合粒径变化;(H-IAK-137@BSA NCs细胞内摄取的流式图和CLSM图像;(J-K)不同内吞抑制处理的细胞对AK-137@BSA NCs摄取水平的变化。


  研究团队进一步验证了AK-137促进其他功能蛋白胞内递送的能力。流式和CLSM结果显示,AK-137可以有效的促进细胞毒性蛋白RNase A、模型抗原OVA、抗炎性蛋白FN的胞内递送(图4A-D)。AK-137@RNase A组细胞凋亡水平显著高于单独的RNase A,这意味着AK-137@RNase A NCs能够有效地在细胞内递送RNase A以降解RNA,从而诱导增强的抗癌细胞毒性(图4E-F)。同时,AK-137介导的OVA胞内递送促进树突细胞的熟化,有望用于潜在的抗肿瘤免疫治疗应用(图4G-H)。 


4.A-D不同细胞摄取AK-137@RNase AAK-137@OVAAK-137@FN的流式图和CLSM图像;(E-F)不同材料处理HeLa细胞后细胞凋亡水平的变化;(G-H)不同材料处理树突细胞后细胞表面CD80CD86表达水平的变化。
研究团队进一步探究了FN的胞内递送产生的生物学效应。巨噬细胞极化实验显示AK-137FN在一定程度诱导巨噬细胞群体从M1表型向M2表型极化,但是效果是有限的AK-137@FN NCsAK-137FN的协同以及增强的FN胞内递送效果的共同作用下表现出最低的CD86水平和最高的CD206水平(图5A-C)。同时,AK-137@FN NCs也可以有效促进巨噬细胞中Arg-1水平的升高,抑制iNOS的表达(图5D,有效促进巨噬细胞向抗炎M2表型的极化另外,AK-137通过促进FN的细胞内递送进一步放大了FN的抗氧化能力,有效降低细胞内ROS水平(图5E-F。得益于AK-137@FN NCs优异的免疫调节活性和抗氧化性能,LPS激活的巨噬细胞内的促炎性细胞因子(TNF-αIL-1βIL-6)的表达水平也被有效降低,并且这种抗炎性能可能是通过抑制PI3K/AktNF-κB信号通路实现的(图5G-J 


5.A-C不同材料处理后MH-S细胞表面CD86CD206表达水平的流式检测结果;(D)不同材料处理后MH-S细胞中Arg-1iNOS的表达水平;(E-F)不同材料处理后MH-S细胞中ROS水平变化;(G-IqPCR分析不同材料处理后细胞内促炎性细胞因子的相对mRNA表达水平;(JWestern blot分析不同材料处理后MH-S细胞中p-AktNF-κB的表达水平。


  受AK-137@FN NCs在体外强大的抗炎活性的启发,研究团队构建了急性肺损伤(ALI)小鼠模型验证AK-137@FN NCs的体内抗炎治疗效果(图6A)。通过检测不同治疗组小鼠肺泡灌洗液中炎症因子的表达证明AK-137@FN NCs能够抑制ALI小鼠肺组织中过度的细胞因子风暴,并升高抗炎性细胞因子IL-10的表达水平(图6B-E)。进一步的实验结果表明,AK-137@FN NCs可通过缓解细胞因子风暴抑制中性粒细胞对肺组织的侵袭(图6F-H),从而有效避免中性粒细胞释放的蛋白水解酶和氧化产物进入肺组织引起肺水肿和肺损伤(图6I-J),对急性肺损伤小鼠表现出优异的治疗效果。 


6.AALI小鼠体内抗炎治疗示意图。(B-E)不同材料治疗后ALI小鼠BALF中促炎因子(TNF-αIL-6IL-1β)和抗炎因子IL-10的表达水平。(F-H)不同组ALI小鼠治疗24 h后肺组织中性粒细胞百分比和BALF中中性粒细胞生物标志物MPO的表达水平。(I-J)不同处理组ALI小鼠肺干湿重比和肺损伤评分。


  研究团队进一步通过关节腔内注射尿酸钠(MSU)晶体构建急性痛风性关节炎(AGA)小鼠模型以评价AK-137@FN NCs在抗炎治疗中的适用性(图7A。体内结果显示,AK-137@FN NCs治疗组可以抑制AGA小鼠的关节肿胀以及红肿热等情况,减缓了AGA小鼠关节腔变小、关节腔液体渗出、炎症细胞侵袭等病理特征(图7B-D。考虑到MSU晶体在关节内的积累可通过激活巨噬细胞中NLRP3炎症小体和NF-κB信号通路促进IL-1βIL-18等炎症介质的分泌,从而诱导关节炎症这一事实。我们进一步的AGA小鼠踝关节TNF-αIL-1β的免疫荧光染色结果显示AK-137@FN NCs显著抑制了踝关节病灶部位TNF-αIL-1β的表达(图7E-F),明显优于单独的载体和蛋白质药物,具有良好的体内抗炎活性。 


7.AAGA体内抗炎治疗示意图。(B-C)不同材料处理后AGA小鼠踝关节肿胀程度和踝关节代表性热像图。D不同材料处理后AGA小鼠踝关节的H&E染色。E-F不同材料处理后AGA小鼠踝关节组织TNF-αIL-1β的免疫荧光染色。


  简而言之,该研究设计的基于含磷树状大分子的蛋白质递送平台具有多个优势:1合成了具有固有免疫调节活性、稳定的含磷树状大分子;2)提供了一种“简单、有效和非侵入性”的蛋白质递送策略,不需要对载体和蛋白质进行额外的功能修饰;3)含磷树状大分子AK-137通过促进功能蛋白的细胞内递送改善了其生物利用度,可在不同的靶细胞内发挥各自的功能,包括癌细胞凋亡、树突细胞成熟或巨噬细胞免疫调节等;4)构建的AK-137@FN复合物通过增强FN的胞内递送并协同AK-137载体自身抗炎性能,在急性肺损伤和急性痛风性关节炎模型中展现出良好的治疗效果。该研究为非阳离子型聚合物基的细胞质蛋白质递送载体的合理设计提供了重要的思路,因而可能扩展蛋白质药物的广泛生物医学应用。


  以上研究成果以“Bioactive Phosphorus Dendrimers as a Universal Protein Delivery System for Enhanced Anti-inflammation Therapy”为题,在线发表于国际著名期刊ACS Nano (DOI: 10.1021/acsnano.3c09589)。东华大学生物与医学工程学院沈明武研究员史向阳教授与法国国家科学研究中心Jean-Pierre Majoral教授为共同通讯作者,东华大学博士生孙虎啸第一作者。该工作得到了国家重点研发计划、上海市科委政府间国际科技合作项目、上海市科委外专项目等项目的资助。


  文章链接:https://doi.org/10.1021/acsnano.3c09589

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(责任编辑:xu)
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