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北化吕永琴教授等 AHM:基于固相印迹筛选合成用于脑利钠肽选择性识别和检测的分子印迹纳米颗粒
2023-02-25  来源:高分子科技

  心力衰竭(HF)是一种临床综合征,HF患者在确诊后一年和五年内死亡率分别约为20%53%。约17%-45%HF住院患者在入院一年内死亡,只有不到一半的患者能够存活五年以上。因此,早期诊断对于HF疾病的早期治疗至关重要。脑利钠肽或B型利钠肽(BNP)是一种心脏神经激素,是通过监测心衰治疗和预防心源性急性呼吸困难的发生来诊断心衰的最重要的心脏生物标志物之一。健康个体血液中BNP 浓度极低,约为20 pg mL?1,重度充血性心衰患者浓度升至约2 ng mL?1目前已开发的用于BNP检测的方法很多,然而,由于早期心衰患者血液中BNP含量很低,同时在体内的半衰期很短(约22 min,目前大多数检测方法不能满足快速准确的要求。因此,开发一种快速、可靠、高灵敏度和高准确度BNP检测方法具有重要的研究意义


  抗体RNA/DNA适配体等亲和试剂由于具有特定的亲和力和选择性而被广泛用于BNP检测,然而这些生物分子存在价格昂贵不稳定易失活等局限性,从而限制其临床应用。分子印迹聚合物(MIP),通常称为塑料抗体,具有制备简单成本低稳定性高等优点,是生物亲和试剂经济高效的替代品。


  为了合成对特定目标物具有高亲和力和选择性的MIP,最佳单体配方选择至关重要。目前,研究者已开发出基于HPLC、流动注射分析或酶联免疫吸附等方法实现最佳配方的快速筛选。尽管取得了良好的效果,但合成的MIP颗粒的印迹位点具有类似于生物多克隆抗体的异质性


  近日,北京化工大学吕永琴教授等人在Advanced Healthcare Materials上发表了基于固相印迹法筛选合成可选择性靶向B型利钠肽(BNP的分子印迹纳米颗粒的新方法。如图1所示,作者使用磁性固相模板,基于固相印迹法筛选合成出含有均匀印迹结合位点的分子印迹聚合物纳米颗粒(nanoMIP)。通过在nanoMIP合成中引入荧光单体荧光素丙烯酰胺(FAM)以实现纳米颗粒的荧光示踪,进而评估不同配方合成的nanoMIPBNP结合性能最终筛选出nanoMIP的最佳合成配方。将荧光碳量子点(CD包裹MIP纳米颗粒中,可以快速灵敏和准确地测定血液样本中BNP的含量。本研究提供了一个很有前景的诊断平台,基于固相印迹方法筛选合成MIP纳米颗粒,实现复杂生物样品中生物标志物特异性识别和快速检测。 


1. aBNP氨基酸序列结构;b)通过将表位多肽固定在SMCC功能化的磁性纳米颗粒上制备磁性模板的过程示意图c)荧光FAM-MIP纳米颗粒的合成过程;dMIP纳米包裹碳量子点的合成过程;e)荧光法检测血清样品中的BNP


  固相多肽模板的合成过程如图1b所示,首先合成Fe3O4磁性颗粒,然后磁性颗粒表面覆二氧化硅壳,进一步修饰氨基,通过表面氨基SMCC反应,引入马来酰亚胺基团来结合模板肽。如图2所示,通过SEMTEMDLSFTIRXRDZeta电位等多种表征手段证明了磁性模板的成功合成。 


2. amagNPbmagNP@SiO2和(c)磁性模板(magNP-P)的SEMdmagNP@SiO2 TEMmagNPmagNP@SiO2magNP@SiO2-NH2magNP-P的(e粒径分布、(fFTIR光谱、(gXRD图谱、(hXPS元素分析、(iZeta电位和(jVSM曲线。


  图1c阐明了基于磁性模板的固相印迹法筛选、合成和纯化荧光纳米MIP的原理。为了制备具有高亲和力的nanoMIP构建了功能单体组合化学文库。将基于不同配方合成的荧光nanoMIP与磁性模板在96孔板中孵育,磁性分离后再与游离的多肽或蛋白质孵育,则游离的多肽或蛋白质会与磁性固相模板竞争与荧光纳米颗粒结合。磁分离测定残余分散液的荧光强度,其强度的高低反映了不同nanoMIP对多肽和蛋白质的亲和力。基于固相印迹筛选方法,最终确定最佳单体配方是10% AAc35% TBAm53% NIPAm。由图3可以看出,基于最佳配方合成的nanoMIP对于目标多肽以及目标BNP具有良好的特异性和选择性 


3. a-c)通过使用磁性模板和荧光FAM单体的竞争荧光分析对MIP合成配方进行组合筛选d-e纳米颗粒对干扰肽、BNP和干扰蛋白(HSABSAMbOVABHb)的结合特异性


  基于最佳单体配方合成的nanoMIP的表征结果如图4所示。BLI测试结果表明,所得nanoMIPBNP表现出高亲和力和选择性,平衡解离常数(KD10?11 M可在7分钟内实现BNP快速检测,检测线性范围为0.255000 pg mL?1,检测限为0.208 pg mL?1。为证明其在临床诊断中的实用性,作者160例真实血清样本进行了检测分析,如图5所示,与医院常规使用的电化学发光检测方法相比,该检测方法的相对标准偏差0.08%-4.43%相对误差-5%-4.98%,相关系数为0.994 


4.a-d纳米颗粒的SEMTEM图;e粒径分布fZeta电位gFTIR光谱;hXPS元素分析i)奈奎斯特图 


5. 真实血清样本的检测结果


  与已报道的检测方法相比,该方法的创新性和优点包括:1)开发了一种基于固相印迹方法筛选合成含有均匀印迹位点的分子印迹人工抗体的新方法;2)利用低成本﹑高稳定性的分子印迹人工抗体替代价格昂贵﹑易失活﹑不稳定的蛋白质抗体;3)开发了一种可快速﹑准确检测BNP的新方法,该方法可在7分钟内完成对血清样品中低浓度BNP的快速检测,检测方法具有高灵敏度和准确性。


  相关论文发表在Advanced Healthcare Materials上,北京化工大学研究生张子楹和中日友好医院检验科副主任为共同第一作者吕永琴教授为通讯作者。


  原文链接:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adhm.202300146


通讯作者简介


吕永琴,北京化工大学生命科学与技术学院教授,博士生导师,国家优秀青年基金获得者,北京市生物加工过程重点实验室副主任。主要在生物化工领域从事以下三个研究方向:(1) 限域微环境调控生物酶催化;(2) /电驱动生物催化;(3) 仿生抗体工程及疾病诊疗。相关研究成果发表论文70余篇,申请发明专利二十余项。先后主持了国家、省部级及企业合作项目十余项。获侯德榜化工科学技术奖青年奖、教育部自然科学奖二等奖、石油化工联合会技术发明奖一等奖等奖项。

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