近日，东华大学洪枫教授团队利用简便的液体施压技术，将丝素蛋白纳米颗粒（silk fibroin nanoparticles, SFNP）快速均一地引入到细菌纳米纤维素（bacterial nanocellulose, BNC）小径管内壁纤维网络，进一步固定后得到BNC-SFNP复合管，通过血液、细胞和动物皮下包埋等研究详细评价了该复合管作为小径人工血管的潜力。该成果以Improved Performance of Bacterial Nanocellulose Conduits by the Introduction of Silk Fibroin Nanoparticles and Heparin for Small-Caliber Vascular Graft Applications为题，作为封面文章（图1）发表于Biomacromolecules（DOI: 10.1021/acs.biomac.0c01211）上。

图1. 文章封面图

  该方法巧妙地利用了BNC独特的天然纳米纤维网络以及氢键在高压水环境中不稳定的特性。肝素（Hep）的引入试图采用以下两种方式（图2）：一是将肝素包裹到SFNP中得到SF-HepNP颗粒，用于BNC-SF-HepNP复合管的构建，另一种是将肝素化学接枝到SFNP上得到BNC-SFNP-Hep复合管。第一种方法中由于SF-HepNP整体粒径较大，通过液体施压技术仅使部分颗粒复合到纤维网络内部。而第二种化学接枝的方法可以使肝素成功复合，并且得到的BNC-SFNP-Hep复合管具有优异的抗凝血、促进内皮细胞增殖，以及抑制平滑肌细胞过度增生的性能，在小口径人工血管中具有极大的应用潜力。

图2. 实验设计示意图。通过负载两种丝素蛋白微球（SFNP）来制备基于BNC的小口径人造血管，一种是肝素（Hep）包裹在微球中，另一种是化学接枝到微球表面；以纯BNC、接枝肝素的BNC-Hep以及复合SFNP的BNC-SFNP为对照，评估血液、细胞以及组织相容性。

  据世界卫生组织年度报告可知，心血管疾病（Cardiovascular diseases，CVD）已成为人类死亡的主要病因。血管重建在动静脉病变、先天性畸形、血管肿瘤和血管支架植入后再闭塞等CVD临床手术中占有重要地位。自体血管移植是血管重建手术中的金标准，但是由于供体来源有限、病人二次创伤等问题远远不能满足临床需求。用涤纶或者膨体聚四氟乙烯材料制备而成的大口径人工血管（内径大于或等于6 mm）已经在临床上广泛使用，但是当它们应用于小口径人工血管时（内径小于6 mm），却由于血管栓塞、内膜增生等问题一直未能成功，因此迄今市场上依旧没有一款小口径人工血管产品。由此可见，构建具有长期畅通率的小口径人工血管是目前研究的重点和难点。

  BNC由于独特的纳米三维网络结构、高纯度以及良好的力学性能和生物相容性，被认为在小口径人工血管领域具有极好的应用潜能。但是，纯粹纤维素缺乏生物活性，不具有主动抗凝血以及显著促进内皮细胞黏附增殖的性能，而天然来源的丝素蛋白（silk fibroin, SF）具有促进内皮细胞增殖的功能，肝素则是临床上广泛使用的抗凝剂。现有常规制备BNC基复合材料一般采用浸渍法，但是复合后的分子很容易爆释，因此采用何种技术巧妙地将SF和肝素复合到BNC管中，成为了该研究的重点。

  针对以上问题，东华大学洪枫教授课题组设计开发了一种基于BNC纳米三维网络结构特性的液体施压技术（中国发明专利ZL201710948421.0和ZL201710949036.8），可将含有高分子、微纳米材料（如SFNP）等的溶液压入风干板结的纤维网络内部，快速充满网络孔隙的同时破坏板结纤维之间的氢键，从而恢复BNC三维网络结构，进一步固定后即得到BNC基复合物。在最近的报道中，研究人员试图通过此技术将两种蛋白颗粒（SFNP和SF-HepNP）压入纤维网络内部，以期制备BNC-SFNP和BNC-SF-HepNP这两种BNC基复合管。图3显示这两种蛋白颗粒具有不同的尺寸，经ImageJ统计可知，包裹了肝素的SF-HepNP直径比未包的SFNP要大一倍以上。复合管产品设计示意图如图4所示。研究表明，由于SF-HepNP粒径较大，进入BNC管壁的较少，而BNC-SFNP粒径小，均一进入管壁后，利用蛋白上的氨基与肝素上的羧基形成酰胺键，进一步肝素化，得到BNC-SFNP-Hep（微观结构如图5所示）。BNC-SFNP-Hep复合管具有优异的抗凝血性能（结果如图6所示），促进内皮细胞黏附增殖以及抑制平滑肌细胞过度增殖的性能（结果如图7所示），大鼠皮下植入后材料周围几乎没有肉眼可见的炎症，且H&E图像显示BNC-Hep和BNC-SFNP-Hep上没有明显的炎性细胞（图8C），表明接枝肝素有利于减轻炎症反应。在BNC-SFNP管上观察到最大的细胞浸润，表明引入蛋白利于细胞的粘附增殖。早期炎症有利于伤口愈合，而长期或过度的炎症则是有害的。因此，研究中所有样本的轻微炎症可能是有益的。Masson的三色染色图像表明细胞分泌产生了胶原，为组织再生提供了适宜的微环境。以上结果均表明BNC-SFNP-Hep在小口径人工血管领域具有更好的应用前景。

图3 （a）DLS分析的微球直径分布，（b）SFNPs和SF-HepNPs的SEM形貌，（c）ImageJ测量统计的微球直径分布。

图4. 产品设计示意图，A为两种SFNP颗粒的制备示意图，B为合成BNC管的生物反应器示意图，C为BNC基复合管的制备过程示意图。

图5. BNC、BNC-SFNP、BNC-SF-HepNP、BNC-Hep和BNC-SFNP-Hep管材内外表面在不同放大倍率下的显微形貌（左：20000×；右：5000×）。

图6 抗凝血性研究，a为溶血率，b为血小板黏附，c为血浆复钙动力学研究，d、e、f分别为c对应的血浆复钙时间、起点和终点吸光度值。

图7. 人脐静脉内皮细胞的细胞毒性（Ⅰ）、活死细胞荧光染色及SEM观察（Ⅲ），人平滑肌细胞的细胞毒性（Ⅱ）、细胞骨架染色和SEM观察（Ⅳ）。

图 8. BNC、BNC-SFNP、BNC-Hep以及BNC-SFNP-Hep管在大鼠皮下移植前（A）和4周后（B）的宏观形态；H&E（C）和Masson三色（D）染色图像。第4行和第6行是第3行和第5行中黄色矩形内组织的放大视图；材料和组织的大致边界用黄色虚线标出，*表示材料一侧。

  论文第一作者为东华大学化学化工与生物工程学院博士生包露涵，通讯作者为细菌纳米纤维制造及复合技术科研基地的洪枫教授。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金和东华大学博士研究生创新基金的资助。

  全文下载链接：https://doi.org/10.1021/acs.biomac.0c01211

  该研究团队长期从事细菌纤维素的低成本高效制备及其高附加值医学应用研究（https://www.researchgate.net/profile/Feng_Hong2），包括在细菌纤维素基小口径人工血管、神经导管、止血海绵、载药纤维素缓释凝胶、功能敷料等生物医学领域开展了大量工作。

  BNC基小口径人工血管研究领域，该团队于国际上首次提出并构建了“双硅胶管”生物反应器用于高效生产一体化管状BNC材料¹，研究比较了不同反应器制备BNC管的培育历程，揭示了BNC合成过程中的溶氧和菌体分布，以及不同培养条件对BNC管的结构和性能的影响²，并详细比较了国内外三种生物反应器制备得到的BNC管的结构和性能差异³。以BNC管为基底材料，制备了BNC-PVA^4，5、肝素化的BNC-壳聚糖⁶、BNC-明胶⁷等一系列复合管，分别在力学性能、抗凝血性、生物活性等方面进行改善，以进一步提升应用于小口径人工血管的潜力。最近，该团队为解决BNC凝胶管储存货架周期短和手术缝合操作难等问题，在国际上又率先评价了风干细菌纤维素小径管在兔颈动脉模型中的替换应用情况⁸。

1. Preliminary study on biosynthesis of bacterial nanocellulose tubes in a novel double-silicone-tube bioreactor for potential vascular prosthesis. BioMed Research International, 2015, 2015, 560365.

2. Comparison of two types of bioreactors for synthesis of bacterial nanocellulose tubes as potential medical prostheses including artificial blood vessels. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 2017, 92, 1218-1228.

3. Physicochemical properties and in vitro biocompatibility of three bacterial nanocellulose conduits for blood vessel applications. Carbohydrate Polymers, 2020, 239, 116246.

4. Potential of PVA-doped bacterial nano-cellulose tubular composites for artificial blood vessels. Journal of Materials Chemistry B, 2015, 3, 8537-8547.

5. 细菌纳米纤维素/聚乙烯醇小径人工血管的制备及其表征. 中国组织工程研究, 2017, 21(34), 5474-5480.

6. Performance improvements of the BNC tubes from unique double-silicone-tube bioreactors by introducing chitosan and heparin for application as small-diameter artificial blood vessels. Carbohydrate Polymers, 2017, 178, 394-405.

7. 肝素/鱼源明胶改性细菌纳米纤维素管用于小口径人工血管的潜力. 纤维素科学与技术, 2019, 27(2), 1-10.

8. Implantation of air-dried bacterial nanocellulose conduits in a small-caliber vascular prosthesis rabbit model.  Materials Science & Engineering C, 2021, 122, 111922