骨骼肌的损伤十分常见，如肌中毒、过高或过低的温度、创伤性损伤以及先天性残疾、退行性肌病等。肌肉自发修复需要耗费较长的恢复时间且效果有限，手术植入组织工程构建体的方法一般具有较大的创伤性并容易带来副作用，而微创性直接注射细胞进行修复的方法则面临所注射细胞从理想的作用位点高度迁移、存活率低等问题，修复效果不理想。

  华侨大学陈爱政教授课题组和哈佛医学院Yu Shrike Zhang（张宇）教授课题组以聚乳酸羟基乙酸（poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA）为原料，通过微流控技术制备高度贯通多孔微载体（highly open porous microspheres, HOPMs），并通过Minitab全因子实验设计方案，考察结果表明聚合物浓度、致孔剂浓度对微载体粒径和孔径的影响显著；而水油比对微载体粒径和孔径的影响不显著。另外，结果表明微流控技术制备微载体过程，受到水-油界面张力和连续相流体剪切力的共同作用。通过改变针头尺寸、乳化功率和连续相/分散相流速比，可成功地制备参数可控的可注射型微载体。

图1. 不同制备工艺下制备的PLGA LPMs扫描电镜图

  为考察所制备的HOPMs能否有效地作为C2C12细胞运载体，对比了静态培养以及三维微重力培养，结果表面其能很好地支持细胞黏附、增殖和生长。随着培养时间的延长，C2C12细胞在微载体上具有较高的黏附率，且动态培养方式较静态培养方式有更高的黏附率。说明微载体的预处理过程增加了蛋白质的吸附量，改善了PLGA微载体的疏水性，并能较好的模拟生物体内的三维生长环境，有利于营养物质、氧气和代谢废物等传质，介导后续C2C12细胞的黏附。同时，通过激光共聚焦显微镜层扫叠加图可以看出，HOPMs接种细胞并体外培养3天后，大部分细胞黏附在微载体表面，其内部细胞较少。但当接种时间延长到12天时，细胞占据整个微载体，并且微载体表面的孔结构完全被C2C12细胞分泌的细胞外基质所覆盖。在分子水平检测表明，复合体在体外在连续培养20天后，MyoD1、Myf 5及Pax7等成肌相关的分子标志表达相对较高，说明HOPMs具有较强的诱导肌向分化的能力以及优异的成肌性能。

图2. （A-i）HOPMs与C2C12共培养后在不同时间段的CLSM 图，静态培养和动态培养不同时间的细胞粘附率(A-ii)及细胞增值率(A-iii)。（B）细胞装载HOPMs培养不同时间后的CLSM层扫叠加图。（C）细胞装载HOPMs的免疫荧光染色图。（D）细胞装载HOPMs的H&E染色图。（E）细胞装载HOPMs的MyoD1、Myf 5及Pax 7的特性表达水平。

  为进一步实验该高度贯通多孔微载体用于骨骼肌细胞微创原位递送的可行性，将细胞装载的HOPMs皮下注射入正常裸鼠体内，并研究其体内增殖和分化情况。相较于直接注射细胞而言，HOPMs可以更好地固定细胞，避免细胞从靶向部位迁移。从H&E染色、Masson染色可以观察到HOPMs注射部位形成有序、密集的肌肉束结构，同时细胞凋亡检测说明HOPMs具有很好的生物相容性。

图3. 细胞装载HOPMs的体内疗效。（A）裸鼠经注射i）生理盐水，ii）HOPMs微载体悬浮于PBS， iii）悬浮细胞（8×10⁶个/mL）悬浮于PBS，和iv）细胞装载HOPMs悬浮在PBS一段时间后生长情况照片。（B） H&E染色。（C） Masson染色。（D）治疗6周后小鼠移植组织Tunel检测：i）悬浮细胞（8×10⁶个/mL）悬浮于PBS，ii）细胞装载HOPMs悬浮于PBS。（E）ACE 2和VEGF-A基因表达。（F）Western blot检测血管生物标志物（ACE 2，7VEGF-A，GAPDH）。

  在组织再生过程中，血管化在其生长中起着关键作用，因为它通过提供所需的营养物质、氧气和清除代谢废物来维持止血。通过分析血管相关特异性基因，如血管紧张素转换酶2（ACE 2）和血管紧张素和血管内皮生长因子（VEGF-A）可以发现，细胞装载的HOPMs治疗组表现出更高的血管相关基因表达。H&E染色和Masson染色也显示HOPMs治疗组有微血管在新形成的肌肉组织中向内生长。通过肌源性标记物Desmin、MYH1、平滑肌肌动蛋白（SMA）、CD31的免疫组化染色进一步证实成肌细胞的血管化、分化及成熟。

图4. 免疫组化分析。A）空白组和B）细胞装载的HOPMs治疗组成肌细胞特异性（Desmin，MYH1）和血管特异性标志物（SMA, CD31）免疫组化染色。

  综上所述，该微流控技术制备高度贯通多孔微载体用于骨骼肌细胞微创原位递送为修复组织缺损及后续的肌肉再生研究提供新思路。

  以上相关成果于6月21日正式发表在Small（DOI:10.1002/smll.201901397）,并被选为封面论文（Front cover）。论文共同第一作者为华侨大学生物材料与组织工程研究所Ranjith Kumar Kankala博士和2018届硕士毕业生赵佳，通讯作者为哈佛医学院张宇（Y. Shrike Zhang）教授和华侨大学陈爱政教授。华侨大学博士生刘晨光、硕士生宋晓杰、王士斌教授和福建医科大学杨达云博士、复旦大学中山医院朱铠博士为论文的共同作者。

  研究工作得到国家自然科学基金海峡联合重点项目《可注射型复合生物支架介导血管化肌组织原位再生的研究》（U1605225）及福建省生物材料科技创新团队项目的资助。

  论文链接：https://doi.org/10.1002/smll.201901397