近日，广东省人民医院张余教授与华中科技大学杨光教授和武汉大学蒋序林教授合作开发了一种可注射水凝胶/多孔微球复合载药的可控释放体系，通过构建组织修复的免疫微环境促进骨和软骨的再生重建，是一种具有极高应用前景的软骨修复策略。

  损伤软骨缺损的纤维修复和软骨下骨的不适当再生可导致再生软骨的退变，最终导致软骨修复的失败，目前尚未有效的解决手段。近年来，基于免疫细胞调控促进组织修复正在成为研究的热点和难点。为了探索免疫调节类的生物材料在骨软骨再生中应用的可行性和科学性，本研究中研发了一种由多孔壳聚糖（CS）微球和羟丙基甲壳素（HPCH）水凝胶组成的具备巨噬细胞调节和可注射性能的 "积木式 "可控药物递送系统，其中二甲氧基甘氨酸（DMOG）负载于在温敏HPCH水凝胶（HD）中，而Kartogenin（KGN）接枝于多孔CS微球（CSK-PMS）。研发的HD/CSK-PMS复合支架可有效地调节缺损部位的再生微环境，募集自体干细胞并提供丰富的细胞黏着位点，实现局部巨噬细胞的M2极化并促进骨软骨的再生。可快速降解的HD有利于透明软骨再生，而高稳定性的CSK-PMS则支持软骨内骨化和软骨下骨的再生，为再生软骨提供支撑。体外和体内实验评价显示基于HD/CSK-PMS分层结构的可控药物输送组合可有效调控M2巨噬细胞微环境，并促进软骨缺损原位骨软骨的再生。进一步通过组织染色、破骨Trap染色和免疫组化探索免疫调节类组织工程材料促进骨软骨重建的机制。本研究结果揭示免疫微环境和软骨下骨对高质量软骨修复的重要性，因此，基于免疫调节的水凝胶/PMS复合体系可能是一种具备极高应用前景的骨软骨再生策略。

图1. 复合体系促进骨软骨修复的示意图

  在这项工作中，作者首先构建了多孔壳聚糖微球和具备温敏性能的羟丙基甲壳素水凝胶，通过EDC-NHS化学方法将疏水性KGN接枝到具备丰富表面积的多孔微球表面及孔隙中，同时采用物理包埋的方式将亲水性的DMOG负载至水凝胶中，多种载药方式可实现亲疏水药物的可控释放。进一步通过FTIR、电镜、流变仪和药物释放等实验对对该复合体系及其药释规律进行了表征。

图2. 多孔微球及温敏水凝胶载药复合系统的制备及材料表征

  随后，作者通过体外细胞实验探究了复合体系对干细胞及巨噬细胞的募集作用及其直接和间接促软骨分化的影响。CCK8、细胞骨架及电镜结果表面多孔微球具备良好的生物相容性和细胞粘附性，微球个体间可通过表面的细胞互相连接，以“积木”的方式构建组织模块。

图3. 多孔微球的细胞黏附和“积木”式组织模块

  进一步通过细胞迁移实验和RT-PCR实验证明复合支架可以通过激活CCL2和MIF基因募集干细胞。同时基于电镜、组织细胞染色和细胞外基质成份分析阐明复合体系具备直接促进干细胞软骨分化的作用，还可以通过巨噬细胞的刺激间接促进软骨生成。

图4. 复合体系的直接和间接促软骨分化作用

  继而以流式细胞分析、RT-PCR、Elisa和皮下植入的免疫荧光染色实验探究了复合体系对巨噬细胞极化状态的影响。结果表明复合体系可以有效地调节巨噬细胞的M2极化，其中DMOG是抑制M1而促进M2基因表达的关键因素，多孔壳聚糖微球可促进巨噬细胞向M2的转化。

图5. 复合体系的体内植入巨噬细胞极化指标免疫荧光

  最后利用大鼠骨软骨缺损模型，通过植入不同组合的水凝胶和多孔微球，优化复合体系的组成，通过micro-CT、组织染色和评分对软骨和软骨下骨的再生修复效果进行全面评价，并通过延长植入时间（18w）观察再生软骨的稳定性和质量。通过Masson染色和破骨Trap染色探索软骨下骨的修复模式及其对再生软骨稳定性的影响，并进一步通过巨噬细胞极化指标的免疫组化对软骨缺损原位和关节滑膜对软骨再生的免疫微环境进行评价和验证，以阐明复合体系通过调控巨噬细胞的极化状态促进骨软骨修复的机制。

图6. 不同组合的水凝胶/多孔微球复合支架植入骨软骨缺损的示意图

  相关研究工作目前以”Injectable immunomodulation-based porous chitosan microspheres/HPCH hydroge composites as a controlled drug delivery system for osteochondral regeneration”为题目发表在Biomaterials上，论文共同第一作者为广东省人民医院纪雄发博士后，华南理工大学邵宏伟硕士和上海硅酸盐研究所李晓宏博士后。广东省人民医院张余教授、华中科技大学杨光教授、武汉大学蒋序林教授和广东省人民医院纪雄发博士后为该文章的共同通讯作者。

  本项目获得了国家自然科学基金项目（32101097），中国博士后科学基金（2020M672558）,广东省基础与应用基础研究基金项目（A2020020）的支持。

  论文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0142961222001703