传统的小分子药物化疗存在水溶性和生物利用度低、治疗效果差、对正常组织致死率高、易被网状内皮系统清除等问题。为了完成药物对肿瘤的靶向递送，人们构建了多种纳米平台，赋予化疗药物特异性靶向能力和延长的血液循环时间。近年来，新一代纳米平台的设计重点是“一体化”策略，即一种整合癌症治疗学的诊断和治疗元素的策略。然而，构建简单和具有生物相容性成分的“一体化”纳米平台以促进多模式肿瘤治疗仍然是一个巨大的挑战。

  最近的研究表明，通过多酚和金属离子的配位形成的金属-酚类网络可将化疗药物负载在其疏水腔中。例如，具有优异生物安全性和生物相容性的天然植物多酚单宁酸（TA），它易于螯合Fe³⁺形成稳定且对pH较敏感的TA-Fe（TAF）纳米复合物，可用于在酸性肿瘤微环境（TME）中化疗药物的pH响应性释放。更重要的是，TAF纳米复合物中的Fe³⁺可用于化学动力学治疗（CDT），从而诱导癌细胞的铁死亡（一种新兴的程序性细胞死亡形式）。简而言之，TAF在TME中解离后，TA可以将Fe³⁺转化为Fe²⁺，然后Fe²⁺可与癌细胞中过表达的过氧化氢（H₂O₂）触发Fenton反应，生成细胞毒性羟基自由基（?OH），并进一步消耗细胞内的谷胱甘肽（GSH）增强诱导癌细胞死亡。通过这种方式，载有化疗药物的TAF纳米复合物可以实现CDT和化疗的联合。此外，在TME下TAF纳米复合物解离的铁离子具有r₁弛豫率，从而实现T₁加权的MR成像。

  对于纳米平台中的靶向输送系统，已有研究人员通过化学偶联等方法用各种靶向配体对治疗药物进行修饰，或通过物理挤压于表面涂覆癌细胞膜。研究发现，纤连蛋白（FN）在其中心的细胞结合结构域具有RGD（Arg-Gly-Asp）多肽序列，因此可以被视为一种靶向配体，以靶向具有高水平α_vβ₃整合素表达的癌细胞。由于其良好的生物相容性和生物降解性，FN可以与TAF纳米复合物结合构建用于有效癌症治疗的纳米药物制剂。

  众所周知，化疗和CDT都可以通过诱导肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡（ICD）来引发抗肿瘤免疫。ICD肿瘤细胞可以分泌三磷酸腺苷（ATP），将钙网蛋白（CRT）从内质网转移到细胞表面，并从细胞核中释放高迁移率族蛋白-1（HMGB-1）。这些损伤相关的分子模式可以促进树突状细胞（DC）的成熟，并进一步激活天然T细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）。尽管ICD肿瘤细胞具有一定的免疫激活效果，但直接激活免疫系统杀死肿瘤细胞的免疫疗法目前已成为极具发展前景的癌症治疗模式，主要包括免疫检查点阻断（ICB）疗法、基于T细胞的过继免疫疗法以及肿瘤疫苗等。由于肿瘤细胞总是通过异常表达免疫检查点（例如程序性细胞死亡配体-1（PD-L1））来逃避T细胞的识别，造成肿瘤的免疫逃逸，因此ICB阻断治疗可以抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，恢复T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，从而逆转TME的免疫抑制。综上所述，整合ICD和ICB治疗手段可增强肿瘤的治疗效果，实现协同的肿瘤免疫治疗。

  为解决小分子化疗药物不可避免的副作用、肿瘤免疫逃逸以及复发等问题，利用FN的修饰促进药物的靶向递送，联合化疗及CDT实现增强的ICD，辅以A-PD-L1免疫检查点阻断疗法，完成增强的肿瘤免疫治疗及MR成像，东华大学史向阳教授团队构建了一种纤连蛋白包覆的金属-多酚网络，通过增强的铁死亡介导的ICD，用于协同的肿瘤化学/化学动力学/免疫治疗以及MR成像（图1）。

图1. DOX-TAF@FN纳米复合物的制备及其用于体内MR成像和肿瘤的化学/化学动力学/免疫联合治疗示意图。

  研究团队首先在DOX存在的情况下，利用TA与Fe³⁺之间的配位作用原位形成负载DOX的TAF（DOX-TAF）纳米复合物。随后，通过氢键作用力将FN包覆于DOX-TAF的表面制备纳米复合物DOX-TAF-FN。制备的DOX-TAF-FN复合物尺寸分布均匀，平均粒径为45.0 nm。

  团队通过UV-vis、SDS-PAGE等手段证明了DOX-TAF@FN的成功制备（图2a-f），且其在水、PBS以及培养基中具有良好的胶体稳定性（图2g）。制备的DOX-TAF@FN在弱酸性条件下（pH=5.5）能够显著释放铁离子（41.7%）（图2h）。此外，亚甲基蓝（MB）降解实验结果表明，DOX-TAF@FN具有催化H₂O₂产生?OH的特性（图2i），从而诱导CDT。

图2.（a-c）DOX-TAF@FN的TEM图及尺寸分布直方图；（d）不同材料的紫外-可见光谱；（e）不同材料的SDS-PAGE分析；（f）不同材料的Zeta电位；（g）DOX-TAF@FN纳米复合物分散在水、PBS及细胞培养基的粒径变化；（h）不同条件下DOX-TAF@FN复合物的Fe释放；（i）在H₂O₂（10 mM）存在下与DOX-TAF@FN纳米复合物在不同条件下孵育后剩余MB的百分比。

  该研究以小鼠黑色素瘤（B16）为模型进行了体外、体内研究，在细胞毒性实验中，随着Fe浓度的增加，TAF和TAF@FN纳米复合物对B16细胞表现出轻微的细胞毒性，这可能归因于Fe(II)诱导的CDT效应（图3a）。DOX-TAF和DOX-TAF@FN均表现出DOX浓度依赖性的细胞活力衰减，并且由于化疗和CDT的组合，表现出更有效的抑制效果（图3b）。而ICP结果表明，所有复合物都显示出在相同Fe浓度下时间依赖性的细胞摄取。在相同的时间点下，B16细胞对Fe的摄取量由大到小为DOX-TAF@FN > DOX-TAF@BSA > DOX-TAF。表明FN可使复合物对表达αvβ3整合素的癌细胞具有靶向特异性（图3c）。细胞内ROS、GSH以及LPO研究结果表明，DOX-TAF@FN能够引起细胞内的ROS（图3d-e）和LPO（图3g）的显著增加，且导致细胞内GSH（图3f）的下降。金属离子螯合剂DFO被用于验证细胞内ROS、GSH以及LPO水平的变化是否与Fe相关，结果表明Fe是DOX-TAF@FN在细胞内发生CDT引起铁死亡的主要因素。

  通过Western blot实验结果表明DOX-TAF@FN显著抑制了SLC7A11和GPX4的表达（图3h）。这些结果表明在经过DOX-TAF@FN处理后，细胞内发生了CDT，且引起肿瘤细胞发生了铁死亡。胞外ATP和HMGB-1的研究结果表明，DOX-TAF@FN能够增加ATP（图4a）及HMGB-1（图4b）的释放。通过Western blot实验定量结果以及激光共聚焦显微镜定性结果表明，DOX-TAF@FN能够引起胞内大量的CRT外翻至细胞膜上（图4c-d），证明了B16细胞ICD的发生。通过Transwell实验及ELISA实验证明，DOX-TAF@FN所引起的ICD能够激活树突细胞，使树突细胞活化（图4e-g）。

图3.（a-b）不同材料处理的细胞活力检测结果；（c）细胞吞噬检测情况；（d-e）经不同材料处理后细胞内ROS变化情况；（f）细胞内GSH水平变化情况；（g）细胞内LPO变化情况；（h）细胞内SLC7A11和GPX4表达水平变化（Ⅰ：PBS；Ⅱ：DOX；Ⅲ：TAF；Ⅳ：DOX-TAF@BSA；Ⅴ：DOX-TAF@FN；Ⅵ：DOX-TAF@FN+DFO；VII：DOX-TAF@FN+Fer-1）。

图4.（a）B16细胞外ATP的释放量；（b）胞外HMGB-1的释放量；（c-d）细胞膜上CRT的表达情况；（e）B16细胞和未成熟的树突细胞（iDC）共培养的示意图；（f）树突细胞的流式分析；（g）树突细胞TNF-α的分泌量。

  随后，研究团队研究了DOX-TAF@FN在B16皮下瘤模型中的MR成像性能以及体内抗肿瘤免疫效应。实验结果表明，该材料具有良好的MR成像效果（图5a，c-e），且通过体内组织分布结果发现DOX-TAF@FN能够在肿瘤部位发生聚集，并可通过网状内皮系统进行代谢（图5b，f）。

图5.（a）DOX-TAF@FN的MR成像特性检测；（b）肿瘤部位的组织分布结果；（c-e）体内MR成像结果；（f）体内组织分布结果。

  抗肿瘤活性及免疫效应结果表明，通过对治疗期间小鼠体重的统计表明DOX-TAF@FN及A-PD-L1无明显系统毒性（图6b），在14天治疗结束后经DOX-TAF@FN+A-PD-L1处理的肿瘤体积最小，即表现出最强的肿瘤抑制效果（图6c-e）。通过对肿瘤部位的免疫组织学观察，Ki-67染色结果表明DOX-TAF@FN+A-PD-L1组的肿瘤部位细胞增殖率远低于其他组（图6f），明显地抑制了肿瘤细胞的增殖。对肿瘤部位的CRT染色结果表明，DOX-TAF@FN+A-PD-L1组增强了肿瘤细胞的免疫原性死亡效应（图6f）。通过免疫荧光染色结果表明，DOX-TAF@FN+A-PD-L1组表现出良好的CD8⁺ T细胞的肿瘤浸润效果（图6f），表明了DOX-TAF@FN+A-PD-L1的联合治疗能够明显地激活小鼠体内的免疫反应，增强体内的抗肿瘤免疫效应。随后进一步分析了体内的免疫细胞表达情况，流式分析结果表明，经DOX-TAF@FN+A-PD-L1联合治疗，肿瘤部位的CD4⁺、CD8⁺ T细胞（图7a，d-e）表达上调，调节性T细胞（Tregs）显著下调（图7b，f），NK细胞（NK1.1）表达上调（图7c，g），证明通过化学/化学动力学/免疫联合治疗能够有效地缓解肿瘤部位的免疫抑制微环境，防止肿瘤的免疫逃逸，增强体内的抗肿瘤免疫反应。

图6.（a）小鼠体内治疗过程示意图；（b-c）治疗14天内小鼠体重及肿瘤体积变化曲线；（d-e）治疗第14天肿瘤照片与质量；（f）治疗第14天肿瘤切片的Ki-67、CRT及CD8⁺染色结果。

图7.（a）肿瘤部位CD4⁺、CD8⁺T细胞的流式分析；（b）Tregs（CD25⁺CD4⁺Foxp3⁺ T细胞）的流式分析；（c）NK细胞（NK1.1⁺）的流式分析；（d-e）CD4⁺、CD8⁺T细胞的流式定量图；（f）Tregs（CD25⁺CD4⁺Foxp3⁺ T细胞）的流式定量图；（g）NK细胞（NK1.1⁺）的流式定量图。

  简言之，该研究设计的DOX-TAF@FN纳米平台的主要优势在于以下几个方面：1）使用简单且生物相容性的成分形成的DOX-TAF@FN纳米复合物能够实现MR成像引导下的靶向肿瘤化学/化学动力学/免疫联合治疗；2）通过化疗联合CDT，增强铁死亡介导的ICD，从而激活免疫细胞；3）DOX-TAF@FN纳米复合物可以通过与A-PD-L1的结合来实现增强的肿瘤治疗，增强抗肿瘤免疫反应。该研究制备的DOX-TAF@FN提出了一个真正多功能化和协作的治疗诊断纳米药物，可用于靶向肿瘤MR成像和联合治疗，为构建新型纳米诊疗药物促进临床转化奠定了基础。

  以上研究成果以“Fibronectin-Coated Metal-Phenolic Networks for Cooperative Tumor Chemo/Chemodynamic/Immune Therapy via Enhanced Ferroptosis-Mediated Immunogenic Cell Death”为题，在线发表于国际著名期刊ACS Nano (DOI: 10.1021/acsnano.1c08585) 。东华大学化学化工与生物工程学院史向阳教授为通讯作者，硕士生徐瑶为第一作者。该工作得到了国家自然科学基金面上项目、上海市科委政府间国际科技合作项目、上海市科委优秀学术带头人计划及国家自然科学基金国际（地区）合作与交流项目等项目的资助。

  原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.1c08585