近年来，作为一种功能强大的自下而上的自组装技术，DNA折纸术（DNA origami）通过将上百条短的单链DNA订书链与一条长单链DNA骨架链之间的碱基互补配对作用对骨架链进行折叠，可以以纳米尺度的精度组装成具有高度可编程性的各种纳米结构。它的出现极大地推动了DNA纳米技术领域的发展。 DNA 折纸纳米结构的应用通常依赖于功能化序列的定位，这些功能序列通常由特定的单链序列组成或附加在特定的单链序列上。当使用常规的M13骨架链或天然存在的单链DNA 序列时，必须将这些功能序列作为订书链的延伸引入。然而，这些延长的短的订书链整合到最终形成的折纸结构中的掺入效率可能受很多因素的影响并且可能较低。此外，当这种具有功能性悬挂链的DNA折纸纳米结构用于生物医学应用时，可能会遭受各种核酸酶尤其是核酸外切酶的降解。 

近日，南京大学现代工程与应用科学学院李喆教授课题组在ACS Applied Materials & Interfaces上发表题为：Aptamer-Integrated Scaffolds for Biologically Functional DNA Origami Structures的研究论文。 该研究报道了一种新的策略来生产具有集成适配体序列的定制化骨架链，从而能够直接构建功能性DNA折纸结构。 作者们通过在M13mp18噬菌粒中插入了两种不同的凝血酶适配体序列（TBA-15 和 TBA-29），获得了整合凝血酶适配体序列的骨架链M13-2TBA15/TBA29。然后，将获得的骨架链M13-2TBA15/TBA29直接组装形成功能性三角形DNA折纸结构（TRI-2TBA15/TBA29），并考察了其体外凝血酶结合的能力。在传统的方法中，凝血酶适配体序列通过订书链延伸的方式修饰到DNA折纸结构上（Staple-2TBA15/TBA29），其与凝血酶的结合效率仅为29%左右。而通过骨架链整合方式组装的功能性 DNA 折纸结构与凝血酶的结合效率为71%左右，并且显示出更强的抗核酸外切酶降解的能力。 此外，作者们还构建了含不同数量的血小板衍生生长因子（Platelet derived growth factor, PDGF）适配体序列的骨架链（M13-3×PApt 和M13-12×PApt），然后探究了以这两种骨架链组装的功能性 DNA 折纸结构（TRI-3×PApt 和TRI-12×PApt）对PDGF高表达的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和低表达细胞系MCF-7增殖的调控作用。与传统方法相比，此功能性 DNA折纸结构对MDA-MB-231 的增殖具有更显著的抑制作用。 总之，该工作首次提出了将核酸适配体序列整合到DNA折纸术骨架链中的策略，包含适配体序列的骨架链可以直接用于组装功能性DNA折纸结构。通过这一方法可以设计和生产由用户自定义的骨架链序列，以在用户定义的位置添加各种功能序列。这种方法可以快速高效的组装具有不同定义模式的功能化DNA折纸结构，并且组装效率与传统的M13骨架链的组装效率几乎完全一致。尽管该方法存在更换适配体的种类和数量时需要重新设计骨架链的这一缺点，但是整体上提高了功能性 DNA 纳米结构的组装效率。 这一方法突破了传统 DNA 折纸纳米结构功能化的连接效率以及稳定性的问题。由于所需的功能序列包含在骨架链中，因此功能序列向组装后 DNA 折纸结构中的掺入率几乎为 100%。 此外，该方法同样具有广泛的通用性。我们设想，这种策略在建造任何形状或大小的更复杂结构方面具有巨大的潜力。例如，可以用更长的骨架链制备更大的携带更多功能像素的DNA折纸。 最后，我们这一方法可以通过生物技术手段大量生产包含各种功能序列的骨架链，并且可以极大的降低构建各种复杂功能性折纸结构时需要大量更改修饰订书链的成本。 通过拓展，可进一步通过分子生物学的方法在微生物细胞中生产各种自我折叠形成的功能性核酸纳米结构，从而为其更广泛的实际应用提供了重要基础。

图 1：适配体整合骨架链的制备及其直接用于组装功能性DNA折纸结构的示意图。（A）将包含适配体序列的定制设计的双链DNA片段插入M13mp18 RF DNA载体中。然后将重组噬菌粒转化到大肠杆菌细胞中并产生大量体内包装的噬菌体颗粒。通过收集和纯化这些噬菌体便可获得相应的单链DNA。（B）序列定制的单链DNA被用于组装功能性DNA折纸纳米结构的骨架链。

图 2：适配体整合骨架链的表征。（A）适配体整合骨架链的凝胶电泳分析。（B）使用适配体整合的骨架链组装功能性三角形DNA折纸的AFM成像图。（C）AFM图像的线截面分析显示DNA折纸上特定适配体位置的高度增加。

图 3：整合2个TBA15和1个TBA29的功能化DNA折纸结构结合凝血酶的AFM成像分析。（A）2个TBA15和1个TBA29通过插入到骨架链（M13-2TBA15/TBA29）的方式整合到DNA折纸结构，（E）2个TBA15和1个TBA29通过订书链延伸（Staple-2TBA15/TBA29）的方式整合到DNA折纸结构；（B和F）凝血酶结合前后 DNA 折纸三角形的AFM成像图以及高度分布（C和G）。DNA折纸三角形的凝血酶结合效率统计（D和H）。所有比例尺：200 nm。

图 4：通过骨架链整合（M13-2TBA15/TBA29）以及订书链延伸（Staple-2TBA15/TBA29）方式构建的适配体功能化DNA折纸结构的核酸外切酶切稳定性分析。外切酶 I 消化后，由 M13-2TBA15/TBA29（A）或 Staple-2TBA15/TBA29（E）组装的DNA折纸三角形上凝血酶结合的AFM成像分析；酶消化前后 DNA 折纸三角形的 AFM 图像（B、F）和高度分布图（C、G）；DNA折纸三角形的凝血酶结合效率（D，H）。所有比例尺：200 nm。

图 5：适配体整合的DNA折纸对细胞增殖的影响。（A）整合不同适配体数量的DNA折纸结构调控细胞增殖的示意图；整合3个（TRI-3×PApt）以及12个（TRI-12×PApt）PDGF适配体的DNA折纸结构对MDA-MB-231和MCF-7细胞增殖的影响（B和C）；（D）适配体整合DNA折纸结构在10% FBS中的预处理示意图；（E）在10% FBS 中预处理24小时后，TRI-staple-12xPApt 和 TRI-scaffold 12xPApt 对MDA-MB-231细胞增殖的影响。

相关链接

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.1c09307