水是生命之源，其不仅仅是蛋白质的溶剂，也是蛋白质维持天然构象和功能的“不可或缺的辅助因子”。但在极度干燥的非极性环境或外太空中，如果只有百万分之一（ppm量级）的水，还能否维持蛋白质折叠结构的稳定？

  近日，东北大学崔树勋教授团队与南京大学郑鹏教授、华南师范大学王衍副研究员合作，利用基于原子力显微镜的单分子力谱（AFM?SMFS），在不同含水量的非极性有机溶剂中直接观测多聚蛋白的单分子力学行为，证实即使是ppm量级的痕量水依旧可以保护蛋白结构，发现80~95 ppm是决定蛋白质“完全变性”与“部分稳定”的临界阈值，为蛋白质长期储存、天体生物学研究提供全新的分子层面视角和依据。

  相关研究以Single-Molecule Studies Reveal That Water Starts to Protect Proteins Even at the ppm Level为题发表在ACS Nano上。论文第一作者为西南交通大学博士生周九龙，通讯作者为崔树勋教授（东北大学）、郑鹏教授（南京大学）和王衍副研究员（华南师范大学）。

  大量热力学与结构生物学研究证实，水分子通过水化氢键网络、疏水效应驱动蛋白质折叠，维持生理条件下蛋白的构象与功能。绝大多数实验都在水溶液环境开展。但蛋白质同样会面临极端缺水场景：跨膜运输、非水酶催化、长期储存、星际环境。天体生物学领域一直关心：陨石、星际尘埃携带的极微量水，是否足以保护蛋白质等生物大分子完成星际输运？

  一系列非极性有机溶剂为探究痕量水对蛋白质结构稳定性的影响提供了理想的实验平台：在该体系中，非极性溶剂分子本身与目标蛋白之间仅存在范德华相互作用，因而溶解在其中的微量水是体系唯一变量。由于蛋白质不溶于非极性溶剂，单分子力谱技术以及分子动力学模拟便成为研究该体系的合适工具。

  本文研究团队选取了(GB1)₈（链球菌蛋白G的B1结构域八聚体）与(I27)₈（肌联蛋白I27结构域八聚体）两种聚蛋白作为研究模型，利用AFM-SMFS系统研究了聚蛋白在四氯乙烷(TCE)、辛烷、壬烷、十四烷四种饱和水含量梯度分布的非极性溶剂中的力诱导解折叠行为。

核心研究结果

1. 水含量≤80 ppm：蛋白质完全变性，仅呈现无规卷曲弹性信号

  在十四烷（~61 ppm）和壬烷（~80 ppm）中，拉伸聚蛋白得到的力-拉伸曲线（F?E曲线）呈现出平滑的“纯弹性”信号（P型曲线），对应于多肽链无规卷曲的纯弹性拉伸行为，可被QMWLC高分子弹性模型很好地描述。说明当环境水含量低于80 ppm，热扰动就足以让多聚蛋白全部解折叠，无法保留任何折叠结构。

2. 水含量≥95 ppm：蛋白质保持部分结构稳定，出现稳定的解折叠信号

  当环境换成辛烷（~95 ppm）和TCE（~1176 ppm）时，力曲线中出现明显的“特征解折叠峰”（O型曲线/T型曲线），其特征解折叠力约为100 pN，与盘基网柄菌细丝蛋白（ddFLN，一种天然的细胞骨架蛋白）和绿色荧光蛋白（GFP）在缓冲液中的解折叠力相当。这说明，此时的水分子已经足以维持蛋白质内部部分片段（亚稳态结构）的稳定性，使其保留机械抗性。

  注意：该解折叠是多个亚稳态片段同步集体解折叠，和水溶液中结构域逐个依次解折叠机制并不相同。

分子动力学（MD）模拟揭示分子机理：微量水会自发富集在蛋白质表面

  利用(I27)₂模型在TCE中开展无外力分子动力学模拟发现：微量水不会均匀分散在有机溶剂里，而是优先聚集在蛋白质周围，重构局部溶剂化环境，形成蛋白水氢键网络，有效减少非极性溶剂分子对蛋白质疏水核心的“入侵”和破坏，从微观局部实现对蛋白的保护作用，支持了单分子力谱的实验结果。

3. 水含量80~95 ppm：临界水阈值

  综合多种溶剂统计，研究确定80~95 ppm是关键临界区间：

• ＜80 ppm：多聚蛋白彻底失稳、完全变性；

• ＞95 ppm：微量水就可以锚定部分亚稳态折叠片段，保留机械抗性。

  水在这里扮演了“分子开关”的角色，仅仅十几ppm的水含量变化，就会造成蛋白质单分子力学行为的巨大切换。

图注：四种非极性有机溶剂中，针对(GB1)₈和(I27)₈所得到的三种F?E曲线（P型、O型和T型）的示意图与统计分析。

研究意义

  该工作刷新了我们对“蛋白质需要多少水才能存活”的认知：不需要大量自由水，仅仅ppm级痕量水分，就足以守住蛋白质部分结构与机械抗性。该研究为蛋白质长期储存和非水相生物催化等应用提供分子机制参考，也为天体生物学中生物大分子星际输运与泛种论等相关研究提供实验依据。

  局限性：作者也指出，目前尚不能完全确定解折叠事件对应的精确结构单元，未来将结合界面振动光谱等多种表征手段进一步探究。

  文章链接：https://doi.org/10.1021/acsnano.6c12797