骨骼肌约占人体重量的45%，其损伤会对人体的正常运动、姿势维持和内脏保护功能造成严重影响。轻微的骨骼肌损伤可以通过激活卫星细胞自发修复，但体积肌肉缺失(VML)的治疗必须进行额外的干预。然而，利用原位骨骼肌组织工程策略的VML修复模式需要具有适当成分、结构和生物活性的支架来促进内源性肌肉干细胞的增殖并进一步诱导其成肌分化。现有研究表明细胞外基质（ECM）可以改善VML修复。但脱细胞法获得的支架由于连通性不足，缺乏多孔结构和血管生成，阻碍了支架中细胞的生存能力和功能表达。脱细胞ECM支架的生物学功能也受到免疫原性的影响。相反，构建相互连通的大孔支架，模拟骨骼肌ECM组成和定向微通道结构，并加载多种促进肌肉组织修复的生长因子，有望大大改善VML修复。

  针对上述问题，采用单向冷冻和循环冻融相结合的方法，制备了基于苯胺四聚体（AT）改性的酰肼化透明质酸（AHA-AT)、明胶（GT）和氧化普鲁兰多糖（OPU）的可生物降解导电各向异性IPN原位冷冻凝胶，其中胰岛素样生长因子-1（IGF-1）主要通过物理混合负载，而血管内皮生长因子（VEGF）则与凝胶动态键合。相关研究成果发表于Nano Today上。西安交通大学材料学院赵鑫副教授和前沿科学技术研究院史梦婷博士担任共同第一作者，材料学院硕士生卓劭闻担任第二作者，西安交通大学前沿科学技术研究院郭保林教授担任通讯作者，主要参与作者还有西安交通大学材料学院憨勇教授和西安交通大学第一附属医院骨科尹战海主任。

图2 (a) AHA和AHA-AT的FT-IR光谱。(b) OPU、AHA/GT/OPU和AHA-AT/GT/OPU的FT-IR光谱。(c) AHA-AT聚合物水溶液及其掺杂樟脑磺酸溶液的紫外可见光谱。(d) 不同前驱体浓度梯度下AHA/GT/OPU冷冻凝胶的形态结构。(e)细胞在有和没有循环冻融过程的冷冻凝胶内的钙黄蛋白染色图像。(f)经过和不经过循环冻融过程的冷冻凝胶中细胞荧光面积的百分比(n=5)。(g) 不同前体浓度的AHA/GT/OPU冷冻凝胶中细胞钙黄蛋白染色图像。(h) 不同前体浓度的AHA/GT/OPU冷冻凝胶中细胞荧光面积百分比(n=5)。C2C12细胞在(i) 1AHA/1GT/0.12OPU、(j) 2AHA/2GT/0.24OPU、(k) 3AHA/3GT/0.36OPU冷冻凝胶中的取向分布。 *p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

图3 (a) 冷冻凝胶的导电性。平行和垂直于(b) 非冻融AHA/GT/OPU、(c) AHA/GT/OPU、(d) AHA-AT5/GT/OPU、(e) AHA-AT10/GT/OPU、(f) AHA-AT15/GT/OPU微通道方向的压缩试验。(g) AHA-AT/GT/OPU冷冻凝胶的溶胀率。(h) AHA-AT/GT/OPU冷冻凝胶的体外降解。(i) AHA-AT10/GT/OPU/IG/VE冷冻凝胶中IGF-1和VEGF的体外释放曲线。

图4 导电冷冻凝胶对C2C12细胞成肌分化影响的评价。(a) 冷冻凝胶中C2C12细胞的MHC免疫荧光染色图像。(b) 肌管数统计(n=5)。(c) AHA/GT/OPU，(d) 各向同性AHA-AT10/GT/OPU，(e) AHA-AT10/GT/OPU，(f) AHA-AT10/GT/OPU/IG，(g) AHA-AT10/GT/OPU/IG/VE冷冻凝胶中肌管的取向分布。

图5 (a) HUVECs划痕和迁移的代表性光学图像。(b) 各冷冻凝胶组细胞迁移率统计(n=5)。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

图6 (a) 治疗1周后大鼠胫骨前肌损伤部位的H&E染色图像（黑色箭头：有核肌纤维；红色箭头：新形成的毛细血管）。(b) 1周后每视场新形成的有核肌纤维数量统计(n=6)。(c) 1周后每个视场新形成毛细血管数量统计(n=6)。(d) 治疗4周后大鼠胫骨前肌损伤部位的H&E染色图像（黑色箭头:有核肌纤维;红色箭头:新形成的毛细血管）。(e) 4周后每个视场新形成的有核肌纤维数量统计(n=6)。(f) 4周后每个视场新形成毛细血管数量统计(n=6)。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

图7 (a) 治疗1周和治疗4周后胫骨前肌损伤部位IL-6和VEGF免疫荧光染色图像。(b) IL-6免疫荧光表达的定量统计(n=3)。(c) VEGF免疫荧光表达的定量统计(n=3)。(d)治疗1周和4周后胫骨前肌损伤部位MHC、MyoD和Tnnt的免疫荧光染色图像。(e) MHC免疫荧光表达的定量统计(n=3)。(f) MyoD免疫荧光表达的定量统计(n=3)。(g) Tnnt免疫荧光表达的定量统计(n=3)。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

  论文信息：

  Authors: XinZhao^?, Mengting Shi^?, Shaowen Zhuo, Ruonan Dong, Lang Bai, Meiguang Xu, Nuanyang Wen, Zhanhai Yin, Yong Han, Baolin Guo^*

  Title: Biodegradable conductive IPN in situ cryogels with anisotropic microchannels and sequential delivery of dual-growth factors for skeletal muscle regeneration

  Published in: Nano Today

  doi: https://doi.org/10.1016/j.nantod.2024.102407